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近年来在海洋软体动物贻贝中发现了新的抗菌肽家族。该家族是由特定基因编码的一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽，根据贻贝抗菌肽家族一级结构的不同可以将其分为4组：Defensins，Mytilins，Myticins和Mytimycin。由于抗菌肽天然产量低，合成抗菌肽的价格又太昂贵，因此应用基因工程技术对其进行克隆与表达，将是研究和开发利用抗菌肽的一条有效途径。 MyticinA是贻贝抗菌肽Myticins中的一种，含有40个氨基酸，对革兰阳性菌有抑制作用，但对革兰阴性菌和真菌的抑制作用不明显。本课题选择MyticinA为研究对象，首先从贻贝体内应用RT-PCR方法获得抗菌肽Myticin A基因，然后将其克隆到毕赤酵母表达载体中，获得的MyticinA酵母工程菌能表达贻贝抗菌肽MyticinA，对表达样品进行纯化和活性研究。 研究的主要内容： 1、MyticinA基因的克隆和重组载体pMD18-MyticinA的构建； 2、重组表达载体pPIC9K-Myticin A的构建； 3、MyticinA在毕赤酵母工程菌GS115／pPIC9K-MyticinA中的诱导表达； 4、表达样品分离、纯化、鉴定及生物学活性的测定。 方法： 1、提取贻贝体液总mRNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增得到DNA片段。 2、PCR产物纯化后与pMD18-T连接，转化大肠杆菌Top10，测序筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-MyticinA。 3、将MyticinA基因定向插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9和pPIC9K中，得到的重组表达载体pPIC9K-MyticinA经线性化后电穿孔转化至毕赤酵母宿主菌GS115中。筛选得到高抗性阳性菌株进行甲醇诱导表达。 4、对发酵上清液进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析。采用CM-sepharose阳离子交换柱和Sephadex G-25层析柱纯化。 5、Western blot鉴定表达样品。硕士学位论文贻贝抗菌肤Myti。in人的克隆表达及生物学活性研究中文摘要 结果: 1、将mRNA逆转录合成cDNA，以其为模板，PcR扩增得到MyticinA基因片段，经DNA序列分析，证实其序列与文献报道的天然抗菌肤MyticinA完全相同。 2、MyticinA基因与pMD 18一T连接，转化大肠杆菌ToPlo，筛选得到阳性重组克隆载体pMD 18一MyticinA，并经DNA序列分析证实。 3、MyticinA基因定向插入毕赤酵母分泌表达载体pPIcg中，得到重组表达载体pPICg一MyticinA，并经双酶切证实。用BamHI/E coRI从重组载体PPICg一MyticinA切下含MyticinA基因的DNA片断，与pPICgK进行重组，经双酶切和DNA序列分析，获得重组表达载体pPICgK一MyticinA。 4、将pPICgK一MyticinA线性化后电穿孔转化至毕赤酵母宿主菌GSI巧中，筛选得到G418高抗性多拷则日性表达菌株GSlls/P PICgK一MyticinA。工程菌经甲醇诱导后，其发酵上清中含有重组表达的MyticinA，Tricine一SDS一队GE证实其分子量为4500 Da，与预期分子量相同，表达量为14%以上。 5、表达产物分离纯化鉴定: ①发酵上清液透析浓缩，进行CM一Sepharose阳离子交换柱(1 .55 emX 20 em)层析，得到3个峰，经抗菌和抑制肿瘤细胞生长活性测定，活性峰为第1峰; ②将活性峰进行G一25柱层析，得到4个峰，经抗菌和抑制肿瘤细胞生长活性测定，活性峰为第4峰，终产物纯度达到90%以上。 ③Westem Blot结果显示有一特异杂交条带，说明所表达样品为MyticinA。 6、贻贝抗菌肤MyticinA的体外生物学活性检测: 扩散法测定纯化产品的抗菌活性，结果显示其对巨大芽胞杆菌(革兰阳性菌)的生长有显著的抑制作用。应用细胞毒检测方法发现纯化的产品对小鼠成纤维细胞(L929)、胰腺癌细胞(s W 1 990)、结肠腺癌细胞(LOVo)的生长均有明显抑制作用。 结论: 应用毕赤酵母表达系统能较好的表达抗菌肤MyticinA，其表达量约占毕赤酵母发酵上清液总蛋白的14%以上。此抗菌肤经Tricine一SDS一PAGE进行分析并用Westem blot进行鉴定。生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用和明显硕士学位论文贻贝抗菌肤Myti。i。A的克隆表达及生物学活性研究中文摘要的抑制肿瘤细胞生长的作用。