中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)属于甲壳类动物,是一种重要的水产经济蟹类,因其体内富含大量的营养物质而被大众所喜爱,但近些年来,中华绒螯蟹因受到病原菌的感染,进而导致其产量有所下降。细菌性疾病是中华绒螯蟹的主要病因,这类疾病均由于水体中的不同致病菌所导致,因此探究中华绒螯蟹抵御细菌的防御机制是目前亟待解决的重要科学问题,同时也为防治病害以及提高其免疫抗病能力提供理论支持。吞噬作用是无脊椎动物先天免疫中非常重要的一种细胞免疫,外源病原体、细胞碎片以及凋亡细胞的清除过程都需要依靠吞噬作用来完成;然而,目前对于中华绒螯蟹吞噬作用的研究甚少,同时近些年来,特异性的先天免疫以及免疫记忆现象在无脊椎动物中被逐渐发现,但这背后的分子机制却并不清楚;唐氏综合征细胞黏附分子Dscam作为免疫球蛋白超家族的成员,被发现在节肢动物中具有超强的分子多样性,同时还参于对不同病原体的防御以及吞噬作用,但目前关于其超强分子多样性的原因以及如何调控吞噬作用的机制未见报道,因此,明确中华绒螯蟹EsDscam与不同细菌的结合方式以及调控吞噬作用的机制,将对阐明无脊椎动物先天免疫特异性分子机制、进一步完善免疫学理论具有及其重要的意义。本研究首先通过全基因组测序获得了EsDscam的完整基因组信息,并通过与cDNA比对后,确定了其基因结构,发现该基因编码的蛋白质在结构上与果蝇等节肢动物的Dscam高度相似,并在理论上可能产生30600种亚型;蛋白质3D结构分析显示EsDscam与果蝇极为相似,同样具有马蹄形结构;通过特异性的EsDscam抗体检测到其蛋白主要表达在肠、心、脑、胃、血细胞以及血淋巴中;利用两种革兰氏阳性菌和两种革兰氏阴性菌刺激血细胞之后,Es Dscam在核酸和蛋白水平上均表现出不同程度的上调趋势;采用TA克隆实验,发现细菌可诱导EsDscam产生不同的亚型;通过与果蝇、水蚤等物种序列进行比对,确定了中华绒螯蟹的epitope I和epitope II序列;这些结果表明不同的细菌可以诱导EsDscam在蛋白水平与核酸水平的上调表达,并能够产生不同种类的亚型。通过对epitope II的序列进行归类,并结合TA克隆的实验结果,体外合成了11条多肽序列;经ELISA检测其与不同细菌存在强结合的方式;体外表达的重组蛋白与不同细菌结合的实验结果显示其可与原细菌产生较强的结合,同时体内的清除实验结果表明特异性的重组蛋白可以促进血细胞对细菌的清除;体外的吞噬实验结果显示特异性的重组蛋白也可以促进血细胞的吞噬作用;通过Western blotting技术,利用特异性的重组蛋白所对应抗体,在血淋巴中确实检测到了与细菌强结合的亚型;分段表达的重组蛋白被检测到对吞噬无作用,同时与细菌的特异性结合能力减弱,这表明马蹄形结构的存在对于与细菌特异性的结合以及调控吞噬反应具有重要的意义。为了探究跨膜型Es Dscam与分泌型EsDscam在调控吞噬中的作用,本研究首先建立了稳定干扰跨膜型EsDscam的体系,并在细菌刺激之后检测其吞噬率,实验结果表明干扰跨膜型EsDscam后,血细胞对细菌的吞噬能力明显减弱;而且利用预先与重组蛋白孵育后的细菌刺激之后,该吞噬能力依然减弱;通过共定位实验发现分泌型EsDscam可与跨膜型EsDscam可以发生共定位;而将特定外显子分别干扰后,血细胞在体外对原细菌的吞噬能力明显减弱;进而利用免疫共沉淀以及Far-western技术检测同源的分泌型与跨膜型EsDscam的相互作用,结果显示在体内体外均可特异的结合;这些结果表明分泌型EsDscam通过跨膜型EsDscam来促进吞噬作用,而该过程依赖相同EsDscam之间的同源结合。综上所述,我们的研究表明EsDscam在细菌刺激后上调,并且通过互斥性可变剪切产生与细菌特异性结合的EsDscam亚型;随后,细菌诱导的特异的分泌型EsDscam与原细菌结合并通过同源的跨膜型Es Dscam来增强血细胞的吞噬作用,这样精确的调控机制的发生可能还与EsDscam细胞质尾介导的胞内信号通路有关;本研究首次阐明了在中华绒螯蟹中EsDscam调控吞噬作用的机制,这为将来更进一步明确其在先天免疫信号通路中的作用奠定了坚实的基础。