骨骼的生长、发育和代谢过程始终包括骨形成和骨吸收作用,分别由成骨细胞和破骨细胞来实现。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,起源于多能骨髓基质中的间质细胞。在成人中,骨髓基质细胞是骨原细胞的来源。骨密度的维持有赖于成骨细胞和破骨细胞的平衡,而骨质疏松症的发生与成骨细胞和破骨细胞的功能失衡有关,因此骨质疏松症防治的方法就着眼于促进成骨细胞的生长和分化,抑制破骨细胞的形成。白藜芦醇能促进骨髓基质细胞向成骨细胞的分化,以剂量依赖的方式提高碱性磷酸酶和脯氨酰羟化酶活性。其在明显促进成骨细胞分化的同时,能抑制脂肪细胞的分化,目前发现白藜芦醇可以激活SIRT1,而后者又能够抑制脂肪的关键调控因子PPAR-γ。但是目前白藜芦醇促进成骨细胞分化的具体机制尚不清楚。从骨髓基质细胞分化为成骨细胞受到一系列激素和局部因子的调控,其中Wnt/β-catenin信号通路起着非常重要的作用。Wnts蛋白是一类分泌型糖蛋白,调控包括骨在内的很多器官和组织的生长和发育。其功能是与其特异性受体卷曲蛋白(Frizzled)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)结合,进而激活Wnt信号通路,包括经典的Wnt/β-catenin信号通路。当缺少Wnt蛋白时,β-catenin可以被CK1和GSK-3β持续磷酸化,并发生泛素化降解;而当Wnt蛋白存在时,没有被磷酸化的β-catenin稳定地累积增多并进入到细胞核内,通过与转录因子TCF/LEF作用,调控下游基因的表达。近年发现,Wnt信号通路中的某些基因的突变导致骨形成异常,例如,LRP5功能丧失性突变可以导致骨质疏松,功能获得性突变能够导致高骨量。与人类似,小鼠的Lrp5缺陷同样会导致骨形成和成骨细胞增殖的下调,而携带获得性功能突变的转基因小鼠的成骨细胞活性增强,凋亡减少,骨密度明显升高。鉴于Wnt/β-catenin在成骨调控中的重要作用,对Wnt信号通路的各个环节的干预,成为治疗骨质疏松新的药物靶点。如国外研究者成功的利用氯化锂抑制GSK-3β的活性,激活Wnt信号通路的下游分子,抑制β-catenin的泛素化降解、使其在细胞质内蓄积增多,并进入细胞核内,引起一系列下游相关基因的表达改变,促进间质细胞向成骨细胞的分化。为此,本研究以Wnt/β-catenin为切入点,探讨白藜芦醇促进骨髓间质细胞向成骨细胞分化的分子机制。第一部分白藜芦醇促进小鼠骨髓间质细胞ST2细胞向成骨细胞分化为了明确白藜芦醇促进间质细胞向成骨细胞分化的作用,我们采用成骨条件培养基(Osteoblast Medium,OBM)和白藜芦醇诱导小鼠骨髓间质细胞系ST2向成骨细胞分化。以成骨细胞分化的早期标志物碱性磷酸酶(ALP)和晚期标志物骨钙素(OCN)以及成骨细胞特异性转录因子Runx2做为检测标志,分析了白藜芦醇对ST2细胞向成骨细胞分化的影响,取得了以下结果:1.白藜芦醇可以明显升高ST2细胞的ALP活性。在浓度为5μM到50μM间呈现剂量依赖效应,高的浓度会对细胞表现出毒性作用。2.采用荧光定量PCR(real-time PCR)检测成骨细胞特异性转录因子Runx2发现,10μM白藜芦醇处理ST2细胞能明显增加Runx2基因表达。3.采用定量RT-PCR分析发现,10μM白藜芦醇能明显促进成骨细胞分化成熟的晚期标志物OCN的表达。以上研究结果表明白藜芦醇能促进小鼠骨髓间质细胞ST2向成骨细胞分化,为下一步研究其分子机制奠定了基础。第二部分白藜芦醇促进成骨细胞分化是通过Wnt信号通路介导的由于Wnt/β-catenin信号通路在骨形成中起重要作用,为了揭示白藜芦醇介导的成骨细胞分化作用的分子机制,本部分围绕Wnt信号通路分析白藜芦醇促进成骨细胞分化的机制,取得了以下结果:1.白藜芦醇能增加ST2细胞中总β-catenin和核β-catenin。β-catenin是Wnt信号通路中的关键分子,是转录结合蛋白TCF/LEF的共激活因子。因此,我们首先检测了白藜芦醇处理对ST2细胞β-catenin总量及其亚细胞分布的影响。发现白藜芦醇处理后,细胞β-catenin的总量和在细胞核内的分布呈现剂量依赖性的升高,证明白藜芦醇可以使β-catenin在ST2细胞核中累积。2.白藜芦醇促进β-catenin靶基因转录。β-catenin在细胞核内与TCF/LEF转录因子相互作用调控Wnt信号通路的靶基因表达。为分析白藜芦醇对Wnt信号通路靶基因的作用,我们采用带有TCF结合位点的荧光素酶报告基因系统(TOPFLASH和阴性对照FOPFLASH)检测β-catenin-TCF依赖的基因表达。发现白藜芦醇可以升高TOPFLASH的活性1.5至2.5倍,浓度在1μM有效,10μM时达到最大效应。结果说明白藜芦醇可以促进含有TCF的启动子结合位点的基因转录。3.白藜芦醇对小鼠Runx2基因启动子区域TCF转录因子的影响:成骨细胞特异性转录因子Runx2基因的启动子包含有一个能够被Wnt蛋白激活的TCF1转录结合位点,通过对比分析野生型和突变该位点的报告基因,发现白藜芦醇能够通过该基因的启动子TCF调控位点促进Runx2转录。4.白藜芦醇激活Wnt信号通路不依赖于Lrp5。Lrp5是Wnt的共受体,为明确白藜芦醇促进成骨细胞分化是否需要Lrp5参与,我们采用RNAi方法抑制Lrp5基因表达,分析了Lrp5在白藜芦醇促进成骨细胞分化中的作用。首先我们构建了Lrp5干扰载体,分析发现稳定表达Lrp5干扰载体的细胞系Lrp5 mRNA水平明显降低,成骨相关的部分标志基因表达也有明显的下调。之后我们对比分析了白藜芦醇对稳定表达干扰载体和对照载体细胞的影响,发现白藜芦醇能明显升高两种细胞的ALP的活性;向以上两种细胞中转染报告基因系统也发现,白藜芦醇能增加两种细胞中报告基因的表达。以上结果说明白藜芦醇促进成骨细胞分化不依赖于Lrp5,其作用靶点很可能位于Lrp5下游。第三部分白藜芦醇通过ERK促使GSK-3β的磷酸化第二部分研究发现白藜芦醇能通过增加细胞核内β-catenin积累而促进成骨细胞分化。由于β-catenin主要通过GSK-3β等的作用而被磷酸化进而被泛素化,而GSK-3β激酶活性能被其自身的磷酸化所抑制。因此,本部分对白藜芦醇处理后细胞内GSK-3β的磷酸化状态及其上游调控分子进行了分析。取得了以下结果:1.10μM白藜芦醇处理细胞能够明显升高GSK-3β的Ser9位的磷酸化水平,结果提示:白藜芦醇通过磷酸化降低GSK-3β的激酶活性,引起了β-catenin的稳定累积入核过程。2.目前普遍认为,GSK-3β可以被PI3-K/Akt,MAPK或者ERK磷酸化,另外一些小分子也会导致GSK-3β的磷酸化,如氯化锂。根据白藜芦醇的生物学作用,我们首先检测了ERK通路,发现白藜芦醇可以明显的促进Erk1/2的磷酸化,而对总Erk1/2没有影响,不仅如此,ERK通路的特异性抑制剂PD98059能够抑制白藜芦醇导致的Erk1/2磷酸化的同时,抑制GSK-3β的磷酸化。另外,PD98059能够抑制白藜芦醇导致的β-catenin在细胞核内的累积。结果提示白藜芦醇激活ERK通路,导致了GSK-3β活性的抑制,从而引起它对Wnt信号通路下游抑制作用的丧失,Wnt信号通路状态的改变最终引起了间质细胞向成骨细胞的分化。第四部分白藜芦醇可以通过对Sirt1和PPAR-γ的作用促进成骨细胞的分化近年的文献报道,Sirt1的激活可以抑制PPAR-γ2,从而抑制间质细胞向脂肪细胞分化,促进其向成骨细胞分化。因此,我们分析了白藜芦醇对Sirt1表达的调控作用。1.白藜芦醇促进人和小鼠SIRT1蛋白表达。研究表明白藜芦醇可以模拟限制能量摄取的作用,激活Sir2。我们检测了白藜芦醇处理后的人U2OS细胞、小鼠ST2细胞,发现白藜芦醇能够明显升高U2OS、ST2细胞中SIRT1的蛋白水平。2.白藜芦醇促进SIRT1的表达需要ERK和p53的磷酸化。我们发现白藜芦醇升高SIRT1表达的同时,p53蛋白上Ser15位的磷酸化水平也升高,而且都可以被ERK通路的抑制剂PD98059所抑制。这些结果表明,白藜芦醇通过激活ERK通路,作用于Wnt/β-catenin,并促进Sirt1和p53的上调,共同对成骨细胞分化起一定的作用。3.白藜芦醇抑制ST2细胞和大鼠脂肪组织中PPAR-γ基因的表达。近年研究表明,在成骨细胞分化过程中PPAR-γ通过不同于Wnt经典信号通路的途径促进β-catenin的泛素化降解,抑制PPAR-γ会抑制间质细胞向脂肪细胞分化,从而增加其向成骨细胞分化,同时PPAR-γ促进成熟的脂肪动员。为了进一步了解Res促进成骨细胞分化的多重机制,我们分析了Res对PPAR-γ基因的转录水平的调控。在ST2细胞中加入梯度浓度的Res(0,1,5,10,50μM),提取RNA,通过RT-PCR检测发现PPAR-γ基因的转录受到Res的浓度依赖的负调控。另外我们选择了成年大鼠进行白藜芦醇的喂饲,分别给予低、中和高三个浓度(4,40 and 100mg/kg体重/天)的白藜芦醇灌胃,取大鼠腹部脂肪组织,检测PPAR-γ的mRNA表达水平,发现白藜芦醇能明显抑制大鼠脂肪组织中PPAR-γ的mRNA表达水平。综上所述,我们的研究结果提示白藜芦醇促进骨髓间质细胞ST2向成骨细胞分化的机制是多方面的,既能通过ERK的磷酸化调控GSK-3β的活性来调控Wnt/β-catenin通路,也可以通过对Sirt1,p53,及PPAR-γ2等分子的作用促进间质细胞向成骨细胞分化抑制其向脂肪细胞分化。深入研究这一网络的作用机制,将有助于选择关键的药物作用靶点,选择有效的药物防治骨质疏松症的发生。