肺癌是常见恶性肿瘤之一，尽管近年来手术、化疗、放疗三大经典治疗手段在不断发展进步，肺癌总的生存率并未得到明显提高，80％的肺癌在诊断后1年内死亡，5年生存率仅为14％。 随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展，肿瘤生物治疗成为一支非常活跃的生力军，其中经典的免疫治疗以其纠正患者免疫缺陷、启动自身特异性杀瘤反应、建立有效的免疫应答成为生物治疗中最有希望的途径之一。树突状细胞(dendriticcells，DCs)是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，是免疫反应的始动者，在诱导免疫应答中具有独特重要的地位。由肿瘤抗原负载DCs激活T细胞从而引发特异性抗肿瘤免疫反应是构建DCs疫苗进行肿瘤免疫治疗的主要目的。 常用于负载DCs的抗原物质有全肿瘤细胞抗原、肿瘤组织总RNA、DNA、肿瘤抗原RNA、DNA、肿瘤抗原肽和肿瘤抗原蛋白等，按照抗原物质的来源可以将这些抗原归为两类：一类是直接从肿瘤组织中获取的抗原物质，另一类是人工合成的抗原物质。全肿瘤细胞抗原和肿瘤组织总RNA、DNA属于第一类，很多研究证实用这类抗原物质负载DCs可以构建疗效较好的DCs疫苗。本研究组曾开展“人肺癌组织总RNA转染树突状细胞构建肺癌疫苗的研究”，证实以肺癌组织总RNA转染DCs能诱导自身T淋巴细胞产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，该CTL对肺癌细胞有特异性杀伤作用。由于这类抗原物质直接来源于肿瘤组织，构建这类疫苗的重要前提是获得一定数量级的肿瘤组织。对于无法获得肿瘤组织的患者，用第二类抗原物质，即人工合成的抗原物质，构建DCs疫苗是非常好的替代方法。这类抗原物质有：体外克隆的肿瘤抗原RNA、DNA、人工合成的肿瘤抗原肽以及肿瘤抗原蛋白，它们的总体MiVnt显微生物图像分析系统完成图像分析。该软件可以将照片中的靶细胞自动计数，并计算靶细胞总面积、分析区域总面积以及靶细胞总面积占分析区域总面积的百分比。CTL杀伤活性的两种计算方法为： 细胞毒性(％)=(阴性对照组靶细胞数—试验组杀伤后靶细胞数)/阴性对照组靶细胞数×100％ 细胞毒性(％)=(阴性对照组靶细胞面积占分析区域总面积百分比—试验组杀伤后靶细胞面积占分析区域总面积百分比)/阴性对照组靶细胞面积占分析区域总面积百分比×100％ 通过分析软件测得参数与实际培养细胞数的相关性和与51Cr释放法测定CTL杀伤活性的结果进行比较，验证该方法的准确性和可靠性。 结果 1.蛋白负载后DCs免疫荧光鉴定荧光显微镜下见蛋白负载的DCs胞浆和胞膜出现荧光，尤以胞膜明显，未经任何蛋白负载的DCs无荧光。 2.蛋白负载前后DCs分泌IL-12水平负载蛋白后DCs分泌IL-12的量(73.00±9.53pg/ml)高于负载前DCs分泌IL-12的量(54.96±7.73pg/ml)(P=0.011)；负载前DCs分泌IL-12的量高于PBMC分泌IL-12的量(14.72±5.02pg/ml)(P＜0.0001)。 3.蛋白负载的DCs刺激淋巴细胞亚群比例的改变DCs两次刺激淋巴细胞后，CD3+/CD8+亚群比例显著上升，由(31.23±3.44)％升至(49.42±5.48)％(P＜0.0001)，CD3+/CD4+亚群和CD56+亚群比例略下降，差异无统计学意义(P=0.144和0.082)。 4.蛋白负载的DCs刺激淋巴细胞分泌IFN-γ水平变化DCs两次刺激后的淋巴细胞分泌IFN-γ的平均点数为163.58±33.21，明显高于DCs刺激1次的淋巴细胞分泌IFN-γ的平均点数71.00±27.42；DCs刺激1次的淋巴细胞分泌IFN-γ的平均点数又明显高于刺激前的淋巴细胞分泌IFN-γ的平均点数3.83±2.21，差异均有显著性意义(P＜0.0001)。 5.CTL杀伤活性测定方法的准确性验证结果软件测得的靶细胞数和靶细胞总面积占分析区域总面积百分比与实际培养的细胞数之间均具有良好的相关性(r=0.985和0.988，P＜0.0001)，提示软件分析得出的这两个参数均可以较好地反映培养板孔中的细胞数目，以这两个参数计算CTL杀伤活性是可靠的。 与51Cr释放法同时检测CTL杀伤活性时，两种检测方法测得的CTL杀伤活性数值均随效靶比的升高而增大，提示两种方法均较稳定；在相同效靶比时，本研究采用的检测方法测得的CTL杀伤活性高于51Cr释放法测定的数值。 6.CTL杀伤活性测定结果对于自体NY-ESO-1阳性肿瘤细胞，NY-ESO-1、XAGE-1b蛋白共同负载的DCs和NY-ESO-1蛋白负载的DCs诱导的CTL杀伤活性较强，高于XAGE-1b蛋白负载的DCs诱导的CTL杀伤活性；对于自体XAGE-1b阳性肿瘤细胞，NY-ESO-1、XAGE-1b蛋白共同负载的DCs和XAGE-1b蛋白负载的DCs诱导的CTL杀伤活性较强，高于NY-ESO-1蛋白负载的DCs诱导的CTL杀伤活性；对于自体NY-ESO-1、XAGE-1b双阳性肿瘤细胞，NY-ESO-1、XAGE-1b蛋白共同负载的DCs诱导的CTL杀伤活性最强，在效靶比为80∶1时可达(51.45±3.5)％，高于NY-ESO-1和XAGE-1b蛋白分别负载的DCs诱导的CTL杀伤活性；CTL对自体NY-ESO-1、XAGE-1b双阴性肿瘤细胞的杀伤活性较低；CTL对自体双阳性肿瘤细胞的杀伤活性高于对异体双阳性肿瘤细胞的杀伤活性；未负载任何蛋白的DCs诱导的CTL对以上肿瘤细胞的杀伤活性最差；CTL对自身肺上皮细胞无杀伤活性。 结论 1.以NY-ESO-1、XAGE-1b蛋白作为抗原物质，采用直接混合培养法，可有效地负载外周血单核细胞来源的DCs。蛋白负载后的成熟DCs分泌IL-12的量显著升高；刺激自身淋巴细胞中CD3+/CD8+亚群比例显著升高；刺激后的淋巴细胞分泌IFN-γ的量显著升高。 2.NY-ESO-1或XAGE-1b蛋白负载的成熟DCs能诱导自身T淋巴细胞产生特异性CTL，对相应抗原基因表达阳性的肺癌细胞有特异性杀伤作用；蛋白交叉诱导的CTL也有一定的杀伤作用；特异性CTL对正常肺组织不产生杀伤作用。 3.NY-ESO-1和XAGE-1b蛋白联合负载DCs，可为CTL提供更多的抗原表位信息，诱导的特异性CTL对两个基因表达均阳性的肺癌细胞的杀伤活性最强，在效靶比为80∶1时可达(51.45±3.5)％。 创新点 1.本研究是国内首例表达完整全长、可溶性NY-ESO-1和XAGE-1b蛋白的研究，也是国内外首例用基因工程合成的NY-ESO-1和XAGE-1b抗原蛋白负载DCs构建肺癌疫苗的研究，肯定了以肿瘤-睾丸抗原蛋白构建肺癌疫苗的可行性和有效性，为无法获取肿瘤组织标本的肺癌患者免疫治疗提供了一条新途径。 2.本研究在国内首先报道了无血清DCs专用培养基联合改良的促成熟细胞因子组合快速培养临床级DCs的方法，该方法避免了含血清培养基的诸多弊端，具有稳定性好、可控性强、重复性高、安全、高效等优点，快速培养方案缩短了DCs体外生长时间，减少DCs受到污染的机会，降低DCs在体外生存时间过久发生活性改变的可能，该方法培养的DCs更适合临床应用。 3.本研究在国内首先报道了AcridineOrange荧光染色法结合MICRO-COSMOSMiVnt显微生物图像分析系统测定CTL对贴壁生长肿瘤细胞杀伤活性的方法。该方法简便、准确、无放射性污染、特异度灵敏度高、重复性好、不需要专门探测荧光强度的设备，是一种值得推广的检测CTL杀伤活性的方法。