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研究背景:平足蛋白（podoplanin,PDPN）是一种I型跨膜唾液酸糖粘蛋白,除了作为淋巴管内皮标记物,PDPN也在多种正常细胞类型如肾小球足细胞中表达,I型肺泡细胞,骨细胞中也有少量表达。最初,PDPN的作用更多体现在胚胎发育及淋巴管形成与发育中,随着研究的深入,发现了 PDPN的其他受体,主要有C型凝集素样受体2（C-type lectin-like receptor 2,CLEC2）,C-C 趋化因子配体 21（C-C motif chemokine ligand 21,CCL21）,乳糖凝集素-8。其中CCL21可以将CCR7阳性的免疫细胞吸引至淋巴管并会影响T细胞的发育,CCL21与PDPN结合也参与了肿瘤的免疫逃逸机制;乳糖凝集素-8在淋巴管内皮上高表达并参与病理性淋巴管生成。CLEC2作为血小板受体,在参与血小板活化、维持血管完整性以及血栓形成方面都有重要作用。目前,PDPN是CLEC2在体内发现的唯一配体,通过PDPN-CLEC2轴,可以引发血小板的活化聚集从而导致血栓生成。CLEC2还在不同免疫细胞中低表达,通过PDPN-CLEC2的结合在骨髓中的血小板生成以及免疫监视中发挥作用。多项研究表明在不同癌症细胞中均有PDPN的表达,如肺癌,口腔癌,黑色素瘤等,高水平的PDPN表达常提示不良预后,如胶质母细胞瘤,食道癌等癌症。肿瘤细胞上的PDPN作用于CLEC2激活血小板,活化的血小板聚集黏附包被在肿瘤细胞周围,既防止了肿瘤细胞抗原位点的暴露从而逃避免疫监视,又减少了血液循环中的机械压力方便肿瘤的生长转移和扩散。骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤,并且极易转移至肺部。尽管化学疗法取得了一定进展,但远处器官转移后的平均生存期不到1年,5年生存率仅20%左右。因此,迫切了解骨肉瘤细胞增殖转移分子机制,研究新的有效靶点为患者提供更多治疗方法是近年来国内外的研究热点。近几年来,我们实验室成功构建了抗PDPN的单克隆抗体SZ168和SZ163,其中SZ168可以抑制肿瘤细胞诱导的人血小板聚集,在小鼠黑色素瘤C8161模型中,SZ168抑制黑色素瘤的生长及转移,因此本研究将应用已制备出的SZ168,进一步探究该单抗在骨肉瘤中的靶向治疗潜力。目的:本研究旨在探索人骨肉瘤细胞上PDPN表达水平的差异,通过体内和体外实验初步阐明骨肉瘤细胞来源的PDPN在介导血小板的聚集以及在骨肉瘤细胞的增殖迁移和小鼠体内生长过程中的作用及机制,同时研究抗人PDPN单抗SZ168是否能抑制骨肉瘤细胞的在体外增殖,迁移和生长作用,判断该单抗靶向治疗的潜力。方法:（1）利用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）和蛋白质免疫印迹实验（Western blot,Wb）检测人骨肉瘤细胞中PDPN的表达水平;（2）利用血小板聚集实验研究人骨肉瘤表达的PDPN对血小板聚集情况的影响,探究鼠抗人PDPN单克隆抗体SZ168通过PDPN-CLEC2通路在血小板聚集过程中的抑制作用;（3）应用Cell Counting Kit-8（CCK8）实验检测与洗涤血小板共培养不同时间后MG63和143B细胞增殖情况的变化,研究SZ168通过PDPN-CLEC2通路在骨肉瘤细胞增殖过程中的抑制作用;（4）应用划痕实验和Transwell迁移实验检测血小板对MG63和143B细胞迁移能力的影响,研究SZ168通过PDPN-CLEC2通路在骨肉瘤细胞迁移过程中的抑制作用;（5）裸鼠体内接种骨肉瘤细胞,构建裸鼠人骨肉瘤原位生长模型,运用小鼠抗人PDPN单克隆抗体SZ168,观察PDPN阻断抗体在SZ168小鼠体内抑制肿瘤生长的作用;（6）应用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0.1软件对上述指标进行分析统计,计量资料采用均数±标准差（x±s）表示,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:（1）通过流式细胞术及WB检测结果可知骨肉瘤细胞143B及MG63在膜上高表达PDPN,HOS几乎不表达;（2）通过血小板聚集实验发现MG63和143B皆诱导血小板的聚集,最大聚集率都在60%-70%左右。将不同浓度抗体SZ168和mIgG分别与肿瘤细胞孵育,结果表明SZ168抑制MG63和143B诱导的血小板聚集,并且抗体浓度越高,抑制率越大。结果显示:在SZ168为45μg/mL时MG63的最大抑制率为90.8±3.0%（n=3）,143B的最大抑制率为83.1 ±2.7%（n=3）。结果提示人骨肉瘤细胞能够诱导血小板的聚集,同时血小板聚集率可以被阻断抗体SZ168抑制;（3）应用CCK8实验检测与不同浓度的洗涤血小板共培养后MG63和143B细胞增殖情况的结果显示,在MG63中,5×105个血小板组（1.62±0.03）的OD值显著高于无血小板组（1.31±0.04）（P＜0.0001）;而在143B中,仅5×106个血小板组（1.30±0.05）OD值远远高于无血小板组（0.83±0.07）,差异具有统计学意义（P＜0.0001）。在上述血小板浓度下,用不同抗体浓度处理细胞,得到结果,在20ug/ml（1.73士0.16）时,与无抗体的MG63空白组（2.17±0.09）相比,SZ168对洗涤血小板促进MG63增殖的抑制效果最为明显（P=0.0007）,此外,在30ug/ml（1.77±0.11）及10ug/ml（1.83±0.10）时,与空白组（2.17±0.09）相比也有抑制作用（P分别为0.0014和0.0033）;而在143B细胞中,与空白组（1.52±0.09）相比,则是30ug/ml（1.25±0.02）组中SZ168抑制作用最为明显（P=0.0030）,抗体浓度在20ug/ml时（1.34±0.03）也有抑制作用（P=0.0445）,以上数据代表3次独立的实验,每次每组有5个复孔（共n=15）;（4）运用划痕实验探究与血小板共培养MG63和143B细胞的迁移能力变化,结果显示,加入血小板后MG63愈合的效果更好,尤其是143B的血小板组,划痕区域基本被细胞覆盖。统计结果显示,培养12h后,MG63空白组（29.71%±3.79%）与血小板组（43.72%±2.73%）的愈合率的差异有统计学意义（P=0.0107）,143B空白组（31.11%±3.58%）与血小板组（61.03%±10.79%）的愈合率同样也有明显差异（P=0.0025）。在12h时,我们比较在不同浓度SZ168单抗以及阴性对照mIgG的作用下,血小板对骨肉瘤细胞迁移的促进作用所受到阻断单抗的影响程度,通过对愈合面积的量化得知:在MG63中,与血小板组（46.78%±1.73%）相比,在20ug/ml SZ168组（35.56%±2.87%）及 40ug/ml SZ168 组（33.66%±2.61%）中愈合率明显下降,差异具有统计学意义（P分别为0.0435和0.0127）:在143B中结果更为显著,与血小板组（46.78%±1.73%）相比,在 20ug/ml SZ168 组（38.42%±2.83%）及 40ug/ml SZ168组（31.06%±0.71%）中愈合率明显下降,差异显著（all P＜0.001）,以上数据代表以上数据代表3次独立的实验,每次每组有3个复孔（共n=9）;（5）运用Transwell细胞迁移实验,探究与血小板孵育后MG63细胞的迁移能力,结果显示,血小板组（118.6±18.68）比空白组（77.2±8.29）的迁移细胞数量有着显著性提升（P=0.0010）,在血小板共培养的基础上,加入mIgG（110.6±5.51）和SZ168（82.6±6.31）后,mIgG组骨肉瘤细胞迁移量和血小板组比较无统计学意义（P=0.6678）,SZ168组发生迁移的细胞数目则显著减少（P=0.0005）,SZ168明显抑制肿瘤迁移,以上数据代表3次独立的实验,每次每组有3个复孔（共n=9）;（6）成功构建裸鼠骨肉瘤原位模型,骨肉瘤细胞143B细胞成瘤率100%,接种肿瘤细胞第15天开始,两组小鼠的肿瘤体积出现差异,mouse IgG组的体积（0.285±0.168）明显高于 SZ168 IgG 组（0.107±0.026）（P=0.0025）,到 20 天时,mouse IgG组（0.448±0.172）和SZ168 IgG组（0.221±0.066）的肿瘤体积差异达到最大（P＜0.0001）,SZ168 IgG 组（397.1 mg±183.7 mg）的肿瘤重量明显低于 mouse IgG组（607.5 mg±238.7 mg）（P=0.0243）,以上数据代表3次独立的实验,每次每组有5只小鼠（共n=15）。结论:（1）骨肉瘤细胞MG63和143B高表达PDPN;（2）通过PDPN-CLEC2通路,人骨肉瘤细胞系MG63和143B体外可以诱导血小板的聚集,活化血小板反过来促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移;（3）PDPN阻断抗体SZ168体外可以抑制骨肉瘤细胞MG63和143B诱导的血小板聚集,能抑制MG63和143B体外增殖和迁移,可以抑制小鼠体内骨肉瘤细胞的生长,单抗SZ168具有骨肉瘤靶向治疗的潜力;（4）骨肉瘤细胞表达的PDPN在骨肉瘤的发生发展中起重要作用;这一研究结果进一步丰富和完善了骨肉瘤的发生机制,为针对骨肉瘤的诊治提供了新靶点。