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研究背景单纯自主神经功能衰竭是一种极罕见、散发性、缓慢进展的自主神经系统疾病,选择性累及外周薄髓和无髓自主神经纤维,其主要临床表现为体位性低血压、偏身少汗或无汗、心率变异性降低、便秘、泌尿功能障碍、勃起功能异常等自主神经功能障碍,涉及循环、消化、内分泌、泌尿生殖以及自主神经等多个领域,临床分类较复杂,诊断较为困难。单纯自主神经功能衰竭与多系统萎缩、帕金森病、路易体痴呆等均属于α-突触核蛋白病,皆由于错误折叠的α-syn阳性包涵体沉积于神经元、神经纤维或胶质细胞所致。单纯自主神经功能衰竭患者尸检结果显示:早期单纯自主神经功能衰竭患者交感神经节内检测到大量α-syn阳性包涵体沉积及神经元丢失,提示交感神经节内错误折叠的α-syn阳性包涵体的形成可能诱导了单纯自主神经功能衰竭。既往研究证实α-syn阳性包涵体在机体内以“朊蛋白样播散”的致病模式在中枢和外周神经系统通路中形成、播散而致病。鉴于上述研究基础,本研究拟于TgM83+/-转基因小鼠腹腔神经节注射α-syn纤维体,诱导α-syn阳性包涵体在腹腔神经节内形成并沿自主神经传导通路播散至中枢神经系统及外周自主神经效应器官,构建国内外首个单纯自主神经功能衰竭动物模型,进一步验证α-syn阳性包涵体播散理论,探索α-syn阳性包涵体在单纯自主神经功能衰竭的特异性播散路径,揭示单纯自主神经功能衰竭的病理机制,填补单纯自主神经功能衰竭动物模型的研究空白。目的通过腹腔神经节注射α-syn纤维体,诱导α-syn阳性包涵体在TgM83+/-转基因小鼠体内形成并沿自主神经传导通路播散至中枢神经系统和外周自主神经效应器官,导致小鼠出现自主神经功能障碍症状而无运动障碍,构建单纯自主神经功能衰竭小鼠模型。方法1.于37℃环境下,使用磁力搅拌器以350 rpm速度将浓度为1 mg/ml的α-syn单体搅拌7天,通过超声处理得到α-syn纤维体,使用透射电子显微镜检测α-syn纤维体的物理性质。在手术显微镜下,向2月龄雄性TgM83+/-转基因小鼠双侧腹腔神经节内注射制备好的α-syn纤维体或PBS缓冲液(每侧4.0μl),术后每月通过给予活性炭评估两组小鼠的胃肠蠕动功能,通过淀粉碘试验评估两组小鼠四肢爪垫的泌汗功能,通过转棒试验、足迹试验、挂线试验和平衡木试验分别评测两组小鼠的运动功能指标,每月取部分小鼠脑、脊髓、双侧腹腔神经节、胃和小肠组织进行免疫组织化学、免疫印迹和免疫荧光分析,定量检测小鼠组织中α-syn阳性包涵体的水平。2.采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7等统计软件分析试验数据,将小鼠分为实验组和对照组,使用配对或未配对的学生t检验,比较免疫组织化学及泌汗功能、行为学等定量结果数据。使用对数秩检验和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验计算生存分析曲线。通过ImageJ软件分析免疫组织化学结果。P≤0.05表示两组之间的差异具有统计学意义,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,检验水准 α=0.05.结果1.体外制备的α-syn纤维体(47.8±23.7 nm)接种至实验组小鼠双侧腹腔神经节,8周后在中枢自主神经传导通路的各节段(第三胸椎、第十一胸椎、延髓、中脑、脑桥上部和下部)均检测出病理性α-syn分布,在自主神经功能相关的神经元中检测出α-syn阳性包涵体形成,脊髓中间外侧柱和椎板Ⅶ出现大量病理性α-syn沉积,α-syn阳性包涵体在小鼠自主神经通路相关核团的沉积,与对照组小鼠相比存在显著差异。单侧注射α-syn纤维体小鼠于8周后出现同侧大脑和脊髓病理性α-syn沉积,首先累及大脑网状结构,12周后逐渐播散至双侧大脑和脊髓。2.与对照组小鼠相比,实验组小鼠在α-syn纤维体注射4周后双侧腹腔神经节内发现病理性α-syn形成,注射8周后在自主神经效应器官(胃肠道和皮肤等)内发现散在的病理性α-syn阳性包涵体形成,随时间推移,实验组小鼠双侧腹腔神经节及自主神经效应器官病理性α-syn含量逐渐升高。单侧注射α-syn纤维体小鼠12周后在自主神经效应器官内发现病理性α-syn阳性包涵体。与对照组小鼠相比,实验组小鼠生存时间显著下降,中位生存时间为24周(对照组小鼠为100周)。3.与对照组小鼠相比,实验组小鼠α-syn纤维体接种14周后胃肠道蠕动功能明显减弱,排便间隔延长,组内比较中,单侧注射α-syn纤维体的小鼠于16周后发生胃肠道蠕动功能障碍,较双侧注射α-syn纤维体小鼠晚。实验组小鼠α-syn纤维体接种14周后出现双侧后爪爪垫处汗腺数量减少,单侧注射α-syn纤维体的小鼠于术后18周双侧后爪爪垫处出现泌汗障碍,实验组和对照组均未出现运动功能障碍。4.实验组小鼠行迷走神经离断术后28周内迷走神经背核区域无发现病理性α-syn沉积,而假手术组小鼠干预8周后即在迷走神经背核及其他神经核团中出现明显的病理性α-syn沉积。结论通过腹腔神经节接种α-syn纤维体,诱导TgM83+/-小鼠体内病理性α-syn形成并沿自主神经传导通路向中枢神经系统和外周自主效应器官双向播散,小鼠出现自主神经功能障碍,而无运动功能障碍,满足单纯自主神经功能障碍疾病特征,为探讨单纯自主神经功能衰竭疾病中病理性α-syn播散机制和评估自主神经功能障碍提供了可靠动物模型。