目的:黑色素瘤(malignant malanoma,MM)是一种严重威胁人们生命的肿瘤,占皮肤恶性肿瘤的第三位,具有恶性程度高﹑侵袭力强的临床特点。外科手术仍是治疗黑色素瘤的首选方法,但是即使外科手术切除,预后仍较差。因此,寻求有效的药物治疗成为黑色素瘤治疗领域的研究热点。维甲酸类(retinoids)包括维生素A的天然及人工合成的衍生物,具有广泛的生物活性。维甲酸对正常上皮的分化具有重要的调节作用,临床上已被用来治疗和预防许多皮肤病及皮肤肿瘤。最近研究表明,维甲酸对多种恶性肿瘤有诱导分化﹑抑制增殖及诱导凋亡等的作用,干扰素具有抗肿瘤和免疫调节作用,维甲酸和干扰素分别属于外源性和内源性的分化诱导剂,二者联合应用,可以提高肿瘤对诱导剂的敏感性,从而降低单药剂量,减少毒副作用,也可提高治疗效果。但在皮肤黑色素瘤方面的研究未见报道。维甲酸类是一种有效预防皮肤肿瘤的药物,其抗皮肤黑色素瘤的机制尚未完全阐明。本研究旨以小鼠黑色素瘤细胞株B16为研究对象,探讨维甲酸、干扰素在不同浓度、不同作用时间对皮肤黑色素瘤细胞增殖抑制作用及形态分化的影响,筛选两药联合应用的最佳作用时间和剂量;探讨两药联合应用对小鼠B16细胞表达PTEN的影响。为干扰素、维甲酸类药物诱导皮肤肿瘤细胞凋亡的基础研究及临床应用提供实验依据。方法:1细胞培养将B16细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml,含链霉素100U/ml,PH7.2)中,置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内常规传代培养。2 MTT比色分析法检测阿维A和干扰素对小鼠B16细胞增殖抑制的影响。2.1不同浓度阿维A(0.1umol/L﹑1.0umol/L﹑10umol/L)分别作用24﹑48﹑72小时后对B16细胞增殖的影响。2.2不同浓度干扰素(500u/ml﹑1000u/ml﹑2000u/ml)分别作用24﹑48﹑72小时后对B16细胞增殖的影响。2.3联合应用1.0umol/L阿维A和1000u/ml干扰素作用48小时后对B16细胞增殖的影响,采用金氏公式分析相互作用指数(q),评价联合后的效应。3倒置相差显微镜观察各组药物处理后对小鼠B16细胞的细胞分化及形态的影响4应用免疫细胞化学s-p法检测各组药物处理后小鼠B16细胞PTEN蛋白的表达情况5采用流式细胞分析术,检测小鼠B16细胞的细胞周期变化和凋亡的发生将实验分为4组,分别为阴性对照组(不加任何药物)﹑阿维A组(1.0umol/L)﹑干扰素组(1000u/ml)﹑阿维A(1.0umol/L)联合干扰素组(1000u/ml)。各组药物干预48小时后,收集各组别细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期分布情况。6流式细胞仪(FCM)检测各药物处理后B16细胞的PTEN蛋白表达情况。7运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计处理,采用单因素方差分析,以a=0.05为差异显著性标准。结果:1 MTT比色分析法检测处理因素对小鼠B16细胞增殖的影响(相对抑制率)1.1阿维A酸组各组间差别具有显著性(p<0.05)。不同浓度的阿维A酸对小鼠B16细胞的抑制作用呈现明显的剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系。1.2干扰素组各组间差别具有显著性(p<0.05)。不同浓度的干扰素对小鼠B16细胞的抑制作用呈现明显的剂量依赖效应和时间依赖效应关系。1.3阿维A联合干扰素组将实验分为4组,分别为阴性对照组(不加任何药物)﹑阿维A组(1.0umol/L)﹑干扰素组(1000u/ml)﹑阿维A(1.0umol / L)联合干扰素组(1000u/ml)。阿维A酸和干扰素联合应用可抑制B16细胞增殖,与阿维A酸或干扰素单独应用比较,差异有显著性(p<0.05)。金氏公式分析表明阿维A与干扰素联合应用对B16细胞有协同的抑制作用。2阿维A及干扰素对小鼠B16细胞分化及形态的影响阴性对照组细胞呈梭形或多角形,贴壁生长,分布均匀,大小基本一致,增殖旺盛,核固缩现象偶见;阿维A作用细胞24小时后,B16细胞出现生长不佳,细胞皱缩﹑破裂,有的细胞两端出现伪足,飘浮细胞增多等现象,随着阿维A作用时间的延长,上述现象更加明显;干扰素细胞呈双极性改变,B16细胞变狭长,脱壁悬浮细胞增多,随着作用时间延长,上述现象更加明显;两者联合应用组细胞生长缓慢,细胞数目减少,脱壁悬浮细胞明显增多,双极性细胞明显可见。3免疫细胞化学法检测干扰素及阿维A诱导前后对小鼠B16细胞PTEN表达情况PTEN蛋白主要表达于细胞浆内,DAB染色呈棕黄色。各组细胞PTEN蛋白阳性表达的程度不同,阴性对照组细胞PTEN表达较弱,呈浅棕黄色;在阿维A组﹑干扰素组及联合用药组B16细胞中,PTEN的染色程度均有不同程度的增强,差异具有显著性(p<0.05)。4流式细胞仪检测各组药物处理后细胞的凋亡情况和细胞周期变化各组药物均能使G1期延滞,G1-S期转化抑制,将细胞阻滞于G0/G1期,使S期细胞的比率减少。阿维A与联合干扰素应用具有协同作用,但二者诱导B16细胞凋亡的作用并不显著。5流式细胞术检测各组药物处理后B16细胞PTEN蛋白的表达情况与阴性对照组相比,各药物处理组作用48小时后,表达PTEN的阳性细胞数升高,阿维A﹑干扰素和联合用药组作用B16细胞48小时后,PTEN蛋白表达荧光指数(FI)分别为1.1233﹑1.2033和1.6300,进一步进行两两比较差异也都具有显著性(p<0.05)。结论:1.阿维A酸和干扰素都能抑制B16细胞的增殖,并且在一定的浓度和时间范围内,二者对B16细胞增殖的抑制率具有量效相关性和时间依赖性。2.阿维A联合干扰素对B16细胞的增殖抑制率优于阿维A和干扰素单用,二者联合应用具有协同作用。3.阿维A酸、干扰素及两药联合应用均可阻断小鼠黑色素瘤细胞B16从G0/G1期进入S期,但两药诱导B16细胞凋亡的作用并不明显4.阿维A酸联合干扰素对B16细胞的抑制作用可能与上调抑癌基因PTEN的表达有关,这可能为其抗肿瘤增殖和促癌细胞分化的机理有关。