【摘 要】
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该实验以小金海棠为研究材料,在缺铁胁迫条件下,利用改进的SDS—苯酚法提取到高质量根部总RNA.利用MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成单链cDNA,用特异引物进行PCR扩增来合
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该实验以小金海棠为研究材料,在缺铁胁迫条件下,利用改进的SDS—苯酚法提取到高质量根部总RNA.利用MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成单链cDNA,用特异引物进行PCR扩增来合成双链cDNA.用CHROMASPIN-400Columm对cDNA进行分级分离,去除小于500bp的cDNA片段.带有粘性末端的双链cDNA与λTripIEx2载体连接,利用λ噬菌体包装蛋白对合成的双链cDNA进行体外包装.包装产物侵染E.coliXL1-Blue后构建cDNA文库,并且对之进行扩增.该cDNA文库的滴度为1.298×10<'6>,文库的克隆数为1.122×10<'6>,扩增后泱工为1.652×10<'10>,插入片段平均在1kb左右,蓝白斑筛选证实其重组率大于99﹪.同时,由于在反转录过程中采用附加序列的方法使全长mRNA得到反转录,故得到的cDNA是完整的,完全符合cDNA文库的要求,成功地构建了缺铁条件下小金棠cDNA文库.
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