渍害和干旱、盐渍、异常温度共同影响着全球的物种分布和产量。玉米是世界上最重要的粮食作物之一,在我国由于季节性降雨尤其是在长江中下游地区,渍害已经成为玉米高产、稳产以及扩大种植面积的重要制约因子。本研究旨采用反向遗传学的研究策略,以玉米耐渍自交系HZ32为材料,筛选玉米苗期根系在淹水胁迫后期过程中诱导表达的基因,揭示玉米苗期在淹水胁迫后期获得适应性应答的分子机制,克隆重要的调控基因,并在进行功能分析的基础上开发可利用于耐渍性改良的分子标记辅助选择的功能标记。取得的主要研究结果如下：1.以耐渍自交系HZ32为材料,选取淹水处理后四个时间点(12h、16h、20h以及24h)的幼苗根系构建正向抑制消减文库,以反向Northern为手段对该文库的768个克隆进行筛选,共筛选到465个诱导表达的EST,共代表295个unigene基因,涉及到了一系列功能,例如信号传导、蛋白质降解、离子运输、碳氮代谢以及转录和翻译调控类基因。表达分析表明,氨基酸代谢链接了蛋白质降解和碳代谢途径,在淹水胁迫后期起着重要作用,并且可能参与了细胞质pH调节以及降解氨基酸碳架给糖酵解途径提供中间产物以支持能量供给。与淹水胁迫前期比较,低氧信号传导途径在淹水后期依然十分活跃,区别于前期,可能参与调节植物后期对长期淹水胁迫的适应。推测淹水胁迫下玉米幼苗根系的应答过程大致可以分为2个阶段：防御和适应。本实验室筛选到的信号传导相关基因可能调控植物在长期的淹水胁迫下进行有效的适应型的应答反应。通过电子定位策略,筛选到的其中63个诱导表达基因与前人定位到的耐渍QTL区间共定位,这些基因可能是重要的候选基因,但仍需进一步验证。2.在上述消减文库中筛选到一个编码脯氨酰羟化酶的基因zmP4H,该基因在淹水胁迫后期在HZ32苗期根系中呈现上调表达。该基因在动物中已被证实是在低氧胁迫下信号感受和传导的关键基因,然而该基因在玉米乃至植物中耐渍应答过程中的作用尚未明了。利用生物信息学方法对玉米全基因组zmP4H的结构、保守motif、系统进化关系以及其在染色体上的区段进行了分析。本研究中分离得到9个编码脯氨酰羟化酶的基因,命名为zmP4H1-9。研究发现其中的5个基因涉及到选择性剪接,这5个成员通过选择性剪接至少产生了19个转录本。同一个基因在不同的自交系中发生的选择性剪接方式不尽相同,这可能与选择性剪接的时空特异性和逆境应答特异性相关。对这些选择性剪接的转录本进行分析,结果表明剪接位点的选择与剪接位点附近的碱基组成密切相关,而那些非组成型的剪接位点的选择很可能与位于剪接位点处的碱基重复序列相关。11个选择性剪接转录本均含有提前终止的密码子,这使得这些转录本很可能遭到无义介导的RNA降解系统的降解。在耐渍材料HZ32中,采用RT-PCR表明zmP4H因在淹水胁迫下表现出不同的应答反应。而选择性剪接产生的转录本在淹水胁迫下也表现出不同的丰度变化,这表现在同一个基因的不同剪接转录中,而不同基因的选择性剪接转录本也如是。这表明在HZ32中,zmP4H在淹水应答过程中受到选择性剪接这种转录后调控机制的调控。3.以本课题组前期筛选到的耐渍相关EST为基础,利用RACE技术,从玉米耐渍自交系HZ32克隆得到zmbRLZ基因全长,序列分析显示, zmbRLZ蛋白质由282个氨基酸组成,从第118位到第182位肽段与BRLZ5和bZIP高度同源,且含亮氨酸重复序列。real time PCR结果显示zmbRLZ基因的表达量在耐渍材料HZ32中淹水后4h达到最大,而在敏感材料Mo17中其表达量则基本维持不变。构建zmbRLZ与GFP融合载体,洋葱表皮的瞬时表达结果表明,zmbRLZ编码的蛋白定位于细胞核,说明zmbRLZ蛋白是能在细胞核中发挥功能的转录因子。对zmbRLZ利用大肠杆菌系统进行体外蛋白质表达,并利用GST标签纯化该蛋白质,凝胶阻滞实验表明,该融合蛋白能够与Adhl基因启动子中的厌氧应答元件序列发生特异地结合,推测其能够调控下游启动子区域里含有ARE顺式元件的应答基因的转录表达。根据自交系HZ32和K12在zmbRLZ基因序列中的SNP设计引物,成功开发了基于SNP的CAPS标记zmbRC/G,利用已构建的(HZ32×K12)F2群体,将zmbRLZ基因定位在SSR标记umc1743和umc1107之间,该区段与课题组前期通过遗传连锁定位的1个玉米耐渍性QTL的密集区域吻合。