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研究背景与目的
随着农业技术的不断进步与发展，农药的开发、合成与使用量也逐渐扩大。大量研究表明，大部分农药具有环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors， EDCs)的一些性质，能够干扰生物体内正常激素的合成与代谢。其中，一类具有不同对映体(Enantiomer)结构的农药逐渐引起了人们的广泛关注，这类农药称为手性农药(Chiral pesticide)，通常具有一个或多个手性中心，因其中的碳、氮、磷等原子与其他不同的原子或电子相连，从而形成不对称的立体分子结构。一般情况下，这类手性农药都以外消旋体(Racemate，Rac)的形式存在。但是据统计，超过四分之一的手性农药也被发现具有EDCs的一些特性：例如在哺乳动物和鱼类中已经发现，拟除虫菊酯类(Pyrethroid)农药通过直接与激素受体相互作用或通过上游的信号传导途径间接阻断、模拟或协同内源激素来干扰信号的传导，从而具有更高的内分泌活性。然而，由于手性农药具有不同的对映体结构，其外消旋体及对映体最终引起的内分泌干扰效应也有所不同。
因此，我们选择了一种典型的手性农药联苯菊酯(Bifenthrin，BF)，利用体外细胞模型研究其对甾体激素受体(Steroid hormone receptor)包括性激素受体(雌激素受体，Estrogenreceptor，ER；雄激素受体，Androgenreceptor，AR；孕激素受体，Progesteinreceptor，PR)和糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)的内分泌干扰效应，以及细胞炎症相关因子的影响，并探究不同对映体之间的对映体选择性差异。此外，还研究了另外两种典型手性农药氟虫腈(Fipronil，FIP)和腈菌唑(Myclobutanil，MT)的性激素受体内分泌干扰效应。针对手性农药对映体具有的内分泌干扰效应的对映体差异研究，将有利于手性农药的安全性评价，避免使用不当对生态环境造成风险，最终为农药的合理开发及利用提供相应的安全性依据。
研究内容
一、联苯菊酯及其对映体对甾体激素受体的内分泌干扰效应
1)联苯菊酯及其对映体的类雌激素作用
2)联苯菊酯及其对映体对ER、AR和PR转录活性的影响
3)联苯菊酯及其对映体对ER表达的影响
4)联苯菊酯及其对映体对雌激素/糖皮质激素响应基因的干扰
5)联苯菊酯及其对映体对细胞炎症反应相关因子TNF?、IL-6、NF-κB和Cox-2的影响
二、氟虫腈及其对映体对性激素受体ER、AR和PR介导的内分泌干扰效应
1)氟虫腈及其对映体的类雌激素作用
2)氟虫腈及其对映体对ER、AR和PR转录活性的影响
三、腈菌唑及其对映体对性激素受体ER、AR和PR介导的内分泌干扰效应
1)腈菌唑及其对映体的类雌激素作用
2)腈菌唑及其对映体对ER、AR和PR转录活性的影响
研究方法
一、使用环境雌激素体外筛检E-Screen法评价手性农药的类雌激素效应。
二、使用双萤光素酶报告基因系统，检测手性农药对ER、AR和PR介导的转录活性的干扰作用。
三、RT-PCR法检测联苯菊酯及其对映体对雌激素受体ER?、ER?表达的影响，对雌激素响应基因pS2表达的影响，对糖皮质激素响应基因酪氨酸氨基移转酶(Tyrosine aminotransferase, TAT )和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPCK)表达的影响，以及对炎症相关因子TNF?、IL-6、NF-κB和Cox-2表达的影响。
研究结果
一、联苯菊酯及其对映体对甾体激素受体介导的内分泌干扰效应
1)联苯菊酯及其对映体的类雌激素效应
通过E-SCREEN实验发现，联苯菊酯及其对映体均能引起MCF-7细胞明显的增殖，且1R-cis-BF的类雌激素效应是1S-cis-BF的1.35倍。
2)联苯菊酯及其对映体对性激素受体(ER、AR、PR)介导的转录活性的影响
①联苯菊酯对ER转录活性存在显著的激动作用，两对映体1S-cis-BF和1R-cis-BF对ER转录活性无显著影响且没有明显的选择性差异。
②联苯菊酯及其对映体对AR转录活性均具有明显的激动作用，其中联苯菊酯在2×10-5mol/及1×10-5mol/L两种实验浓度下均表现出刺激作用，两种对映体对AR的激动效应为1R-cis-BF>1S-cis-BF，且两对映体间的效应存在显著差异。
③联苯菊酯及其对映体对PR转录活性均表现出显著的拮抗效应，但对映体之间无显著性的差异。
3)联苯菊酯对雌激素受体两种亚型的表达的影响。
两种对映体对ERα的表达无影响，但均能明显抑制β(ERβ)的表达，其中1R-cis-BF使得ER?的表达降低至55%，1S-cis-BF降低至42%。
4)联苯菊酯及其对映体对雌激素响应基因pS2表达无影响。
5)联苯菊酯及其对映体对糖皮质激素响应基因PEPCK的表达有显著抑制作用，但对TAT基因表达无影响。
6)联苯菊酯及其对映体对TNF?的表达没有显著的影响；对IL-6、NF-κB及Cox-2的表达均有不同程度的抑制作用，但三者的抑制作用无显著差异。
二、氟虫腈及其对映体性对性激素受体介导的内分泌干扰效应
1)氟虫腈及其对映体的类雌激素效应
通过E-SCREEN实验发现，氟虫腈及其对映体均不能引起MCF-7细胞明显的增殖。
2)氟虫腈及其对映体对性激素受体(ER、AR和PR)介导的转录活性的影响
①氟虫腈及其对映体1S-cis-FIP具有增强ER转录活性作用，且氟虫腈的效率(23%)大于1S-cis-FIP(19%)。
②氟虫腈具有显著的抑制AR转录活性作用，但两个对映体对AR作用不显著。
③氟虫腈及其对映体对PR转录活性均表现出显著的拮抗效应，且两种对映体之间无显著性的差异。
三、腈菌唑及其对映体对性激素受体介导的内分泌干扰效应
1)腈菌唑及其对映体的类雌激素效应
通过E-SCREEN实验发现，腈菌唑及其对映体均不能引起MCF-7细胞明显的增殖。
2)腈菌唑及其对映体对性激素受体(ER、AR和PR)介导的转录活性的影响
①腈菌唑表现出较强的ER拮抗活性，但两种对映体没有影响。
②腈菌唑及其对映体1R-cis-MT对AR转录活性具有显著的增强作用，与阴性对照组相比，腈菌唑增强了2.30倍，对映体1R-cis-MT增强了1.25倍。
③腈菌唑及其对映体对PR转录活性均表现出显著的拮抗效应，且三者之间无显著性的差异。
结论
1.联苯菊酯
1)细胞增殖研究结果表明联苯菊酯及对映体均表现出类雌激素活性。
2)性激素受体介导的转录活性研究结果表明联苯菊酯有类雌激素活性、类雄激素活性和抗孕激素活性。两种对映体的类雌激素作用不明显；具有类雄激素效应且1R-cis-BF＞1S-cis-BF；具有抗孕激素作用但两种对映体之间无差异。
3)联苯菊酯不影响ER?的表达，其对映体仅显著抑制ER?的表达，对ER?的表达无明显的影响。
4)联苯菊酯及其对映体不影响雌激素响应基因pS2的表达；但可以显著抑制糖皮质激素响应基因PEPCK的表达。
5)联苯菊酯及其对映体可抑制部分细胞炎症因子的表达。
2.氟虫腈
1)细胞增殖实验结果表明氟虫腈及其对映体不具有类雌激素作用。
2)性激素受体介导的转录活性实验结果分析表明氟虫腈有类雌激素、抗雄激素和抗孕激素效应；其两种对映体有抗孕激素效应，1S-cis-FIP还表现出ER激活效应。
3.腈菌唑
1)细胞增殖实验结果表明腈菌唑及其对映体不具有类雌激素作用。
2)性激素受体介导的转录活性实验结果表明腈菌唑有抗雌激素、类雄激素和抗孕激素作用；其对映体有抗孕激素作用，而对映体1R-cis-MT还具有类雄激素作用。
随着农业技术的不断进步与发展，农药的开发、合成与使用量也逐渐扩大。大量研究表明，大部分农药具有环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors， EDCs)的一些性质，能够干扰生物体内正常激素的合成与代谢。其中，一类具有不同对映体(Enantiomer)结构的农药逐渐引起了人们的广泛关注，这类农药称为手性农药(Chiral pesticide)，通常具有一个或多个手性中心，因其中的碳、氮、磷等原子与其他不同的原子或电子相连，从而形成不对称的立体分子结构。一般情况下，这类手性农药都以外消旋体(Racemate，Rac)的形式存在。但是据统计，超过四分之一的手性农药也被发现具有EDCs的一些特性：例如在哺乳动物和鱼类中已经发现，拟除虫菊酯类(Pyrethroid)农药通过直接与激素受体相互作用或通过上游的信号传导途径间接阻断、模拟或协同内源激素来干扰信号的传导，从而具有更高的内分泌活性。然而，由于手性农药具有不同的对映体结构，其外消旋体及对映体最终引起的内分泌干扰效应也有所不同。
因此，我们选择了一种典型的手性农药联苯菊酯(Bifenthrin，BF)，利用体外细胞模型研究其对甾体激素受体(Steroid hormone receptor)包括性激素受体(雌激素受体，Estrogenreceptor，ER；雄激素受体，Androgenreceptor，AR；孕激素受体，Progesteinreceptor，PR)和糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)的内分泌干扰效应，以及细胞炎症相关因子的影响，并探究不同对映体之间的对映体选择性差异。此外，还研究了另外两种典型手性农药氟虫腈(Fipronil，FIP)和腈菌唑(Myclobutanil，MT)的性激素受体内分泌干扰效应。针对手性农药对映体具有的内分泌干扰效应的对映体差异研究，将有利于手性农药的安全性评价，避免使用不当对生态环境造成风险，最终为农药的合理开发及利用提供相应的安全性依据。
研究内容
一、联苯菊酯及其对映体对甾体激素受体的内分泌干扰效应
1)联苯菊酯及其对映体的类雌激素作用
2)联苯菊酯及其对映体对ER、AR和PR转录活性的影响
3)联苯菊酯及其对映体对ER表达的影响
4)联苯菊酯及其对映体对雌激素/糖皮质激素响应基因的干扰
5)联苯菊酯及其对映体对细胞炎症反应相关因子TNF?、IL-6、NF-κB和Cox-2的影响
二、氟虫腈及其对映体对性激素受体ER、AR和PR介导的内分泌干扰效应
1)氟虫腈及其对映体的类雌激素作用
2)氟虫腈及其对映体对ER、AR和PR转录活性的影响
三、腈菌唑及其对映体对性激素受体ER、AR和PR介导的内分泌干扰效应
1)腈菌唑及其对映体的类雌激素作用
2)腈菌唑及其对映体对ER、AR和PR转录活性的影响
研究方法
一、使用环境雌激素体外筛检E-Screen法评价手性农药的类雌激素效应。
二、使用双萤光素酶报告基因系统，检测手性农药对ER、AR和PR介导的转录活性的干扰作用。
三、RT-PCR法检测联苯菊酯及其对映体对雌激素受体ER?、ER?表达的影响，对雌激素响应基因pS2表达的影响，对糖皮质激素响应基因酪氨酸氨基移转酶(Tyrosine aminotransferase, TAT )和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPCK)表达的影响，以及对炎症相关因子TNF?、IL-6、NF-κB和Cox-2表达的影响。
研究结果
一、联苯菊酯及其对映体对甾体激素受体介导的内分泌干扰效应
1)联苯菊酯及其对映体的类雌激素效应
通过E-SCREEN实验发现，联苯菊酯及其对映体均能引起MCF-7细胞明显的增殖，且1R-cis-BF的类雌激素效应是1S-cis-BF的1.35倍。
2)联苯菊酯及其对映体对性激素受体(ER、AR、PR)介导的转录活性的影响
①联苯菊酯对ER转录活性存在显著的激动作用，两对映体1S-cis-BF和1R-cis-BF对ER转录活性无显著影响且没有明显的选择性差异。
②联苯菊酯及其对映体对AR转录活性均具有明显的激动作用，其中联苯菊酯在2×10-5mol/及1×10-5mol/L两种实验浓度下均表现出刺激作用，两种对映体对AR的激动效应为1R-cis-BF>1S-cis-BF，且两对映体间的效应存在显著差异。
③联苯菊酯及其对映体对PR转录活性均表现出显著的拮抗效应，但对映体之间无显著性的差异。
3)联苯菊酯对雌激素受体两种亚型的表达的影响。
两种对映体对ERα的表达无影响，但均能明显抑制β(ERβ)的表达，其中1R-cis-BF使得ER?的表达降低至55%，1S-cis-BF降低至42%。
4)联苯菊酯及其对映体对雌激素响应基因pS2表达无影响。
5)联苯菊酯及其对映体对糖皮质激素响应基因PEPCK的表达有显著抑制作用，但对TAT基因表达无影响。
6)联苯菊酯及其对映体对TNF?的表达没有显著的影响；对IL-6、NF-κB及Cox-2的表达均有不同程度的抑制作用，但三者的抑制作用无显著差异。
二、氟虫腈及其对映体性对性激素受体介导的内分泌干扰效应
1)氟虫腈及其对映体的类雌激素效应
通过E-SCREEN实验发现，氟虫腈及其对映体均不能引起MCF-7细胞明显的增殖。
2)氟虫腈及其对映体对性激素受体(ER、AR和PR)介导的转录活性的影响
①氟虫腈及其对映体1S-cis-FIP具有增强ER转录活性作用，且氟虫腈的效率(23%)大于1S-cis-FIP(19%)。
②氟虫腈具有显著的抑制AR转录活性作用，但两个对映体对AR作用不显著。
③氟虫腈及其对映体对PR转录活性均表现出显著的拮抗效应，且两种对映体之间无显著性的差异。
三、腈菌唑及其对映体对性激素受体介导的内分泌干扰效应
1)腈菌唑及其对映体的类雌激素效应
通过E-SCREEN实验发现，腈菌唑及其对映体均不能引起MCF-7细胞明显的增殖。
2)腈菌唑及其对映体对性激素受体(ER、AR和PR)介导的转录活性的影响
①腈菌唑表现出较强的ER拮抗活性，但两种对映体没有影响。
②腈菌唑及其对映体1R-cis-MT对AR转录活性具有显著的增强作用，与阴性对照组相比，腈菌唑增强了2.30倍，对映体1R-cis-MT增强了1.25倍。
③腈菌唑及其对映体对PR转录活性均表现出显著的拮抗效应，且三者之间无显著性的差异。
结论
1.联苯菊酯
1)细胞增殖研究结果表明联苯菊酯及对映体均表现出类雌激素活性。
2)性激素受体介导的转录活性研究结果表明联苯菊酯有类雌激素活性、类雄激素活性和抗孕激素活性。两种对映体的类雌激素作用不明显；具有类雄激素效应且1R-cis-BF＞1S-cis-BF；具有抗孕激素作用但两种对映体之间无差异。
3)联苯菊酯不影响ER?的表达，其对映体仅显著抑制ER?的表达，对ER?的表达无明显的影响。
4)联苯菊酯及其对映体不影响雌激素响应基因pS2的表达；但可以显著抑制糖皮质激素响应基因PEPCK的表达。
5)联苯菊酯及其对映体可抑制部分细胞炎症因子的表达。
2.氟虫腈
1)细胞增殖实验结果表明氟虫腈及其对映体不具有类雌激素作用。
2)性激素受体介导的转录活性实验结果分析表明氟虫腈有类雌激素、抗雄激素和抗孕激素效应；其两种对映体有抗孕激素效应，1S-cis-FIP还表现出ER激活效应。
3.腈菌唑
1)细胞增殖实验结果表明腈菌唑及其对映体不具有类雌激素作用。
2)性激素受体介导的转录活性实验结果表明腈菌唑有抗雌激素、类雄激素和抗孕激素作用；其对映体有抗孕激素作用，而对映体1R-cis-MT还具有类雄激素作用。