论文部分内容阅读
研究背景及意义:肾透明细胞癌（clear cell Renal Cell Carcinoma,ccRCC）是常见的恶性肿瘤之一,ccRCC位于泌尿系统恶性肿瘤发病率第二位,是最常见的肾脏肿瘤。患者术后易复发和转移,整体预后较差。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是近年来新发现的一种非编码RNA,在肿瘤中发挥着重要的作用,是潜在的治疗新靶点和诊断标志物。目前已发现一些在ccRCC中差异表达的circ RNA,具有调控肿瘤进程的功能,但是circ RNA在ccRCC发生和发展中的作用机制尚未阐明。因此,继续深入探索circ RNA在ccRCC中的功能及其分子机制,对于寻找新的ccRCC诊断标志物和治疗靶点具有重要的意义。研究的目的:1.筛选ccRCC中差异表达的circ RNA,明确hsa＿circ＿0001741在ccRCC中的表达及其与临床病理特征的相关性。2.研究hsa＿circ＿0001741在ccRCC中的体内体外功能。3.探索hsa＿circ＿0001741抑制ccRCC转移的作用机制。4.探索影响hsa＿circ＿0001741成环的机制。研究方法:第一部分:ccRCC中环状RNA hsa＿circ＿0001741的筛选、表达分析及其与临床病理特征的关系。1.选取4对配对ccRCC组织及癌旁组织,进行ce RNA芯片测序。根据限定环状RNA的大小、表达丰度和差异倍数等条件筛选差异表达的circ RNAs。2.鉴定hsa＿circ＿0001741的成环特性:设计hsa＿circ＿0001741的特异性扩增引物,并通过Sanger测序鉴定PCR产物是否跨hsa＿circ＿0001741的剪接接口;用Oligo d T引物逆转录或以g DNA为模板检测是否能扩增hsa＿circ＿0001741;通过RNase R消化总RNA或放线菌素D处理细胞后检测hsa＿circ＿0001741的表达,验证hsa＿circ＿0001741的RNA稳定性。3.通过荧光原位杂交实验检测hsa＿circ＿0001741在Caki-1和RCCJF细胞中的定位;利用细胞核质分离实验检测hsa＿circ＿0001741在细胞核和细胞质中的表达。4.选取110对配对ccRCC组织及癌旁组织,qRT-PCR检测hsa＿circ＿0001741及其亲本基因TNPO3的表达,并分析临床资料,探索hsa＿circ＿0001741的临床意义。第二部分:hsa＿circ＿0001741体内外抑制ccRCC增殖和转移的作用研究。1.针对hsa＿circ＿0001741剪接接口处设计si RNA,以及利用p CDci R载体构建hsa＿circ＿0001741的过表达载体。通过transwell、细胞划痕实验检测干扰或过表达hsa＿circ＿0001741对ccRCC细胞迁移能力的影响;western blot实验验证hsa＿circ＿0001741对EMT通路相关蛋白分子的调控作用。构建稳定干扰hsa＿circ＿0001741的Caki-1和RCCJF细胞,通过平板克隆、CCK-8、Ed U实验检测hsa＿circ＿0001741对细胞增殖能力的变化。2.利用慢病毒系统构建稳定干扰hsa＿circ＿0001741的786-O和Caki-1细胞株,利用裸鼠皮下植瘤模型、腹腔播散模型和尾静脉肺转移模型评价hsa＿circ＿0001741对裸鼠ccRCC生长及转移的影响。第三部分:hsa＿circ＿0001741通过结合胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白2（Insulin-like growth factor 2 m RNA-binding protein 2,IGF2BP2）,协同影响丝氨酸家族H成员1（Serpin Family H Member 1,SERPINH1）的m RNA稳定性,抑制ccRCC细胞迁移的机制研究。1.探讨hsa＿circ＿0001741发挥功能的作用方式:通过starbase和circular RNA interactome网站预测能与hsa＿circ＿0001741互作的micro RNA,通过双荧光素酶实验和RNA pull-down实验验证二者是否互作;通过circ RNADb网站,预测hsa＿circ＿0001741翻译多肽的潜能;通过starbase网站预测可能与hsa＿circ＿0001741互作的RNA结合蛋白（RBP）,并通过RNA pull down实验和RIP实验验证hsa＿circ＿0001741与候选RBP的相互作用。2.验证hsa＿circ＿0001741与IGF2BP2的相互作用:在Caki-1细胞中干扰IGF2BP2后,通过RIP实验,验证IGF2BP2与hsa＿circ＿0001741的结合;通过构建IGF2BP2的截断突变体检测hsa＿circ＿0001741与IGF2BP2的结合位点;通过FISH-IF共定位实验验证二者的结合作用。3.IGF2BP2在ccRCC中的表达以及功能研究:利用qRT-PCR、western blot以及免疫组化实验验证IGF2BP2在ccRCC中的表达情况;合成IGF2BP2的si RNA以及利用p CDNA3.1的载体构建IGF2BP2过表达质粒,随后通过transwell实验,验证干扰或过表达IGF2BP2对Caki-1和RCC-JF细胞迁移能力的影响;通过hsa＿circ＿0001741和IGF2BP2的transwell回复实验,验证hsa＿circ＿0001741是否能通过IGF2BP2影响Caki-1和RCC-JF细胞的迁移能力。4.筛选hsa＿circ＿0001741与IGF2BP2共同调控的下游靶基因:通过分析Caki-1细胞中干扰hsa＿circ＿0001741以及干扰IGF2BP2的RNA测序结果,以及Caki-1细胞中的IGF2BP2-RIP测序结果,结合TCGA数据库中ccRCC的差异表达基因,四者寻找交集,找到候选的下游靶基因。qRT-PCR、western blot实验以及回复实验验证hsa＿circ＿0001741和IGF2BP2对下游靶基因SERPINH1 m RNA和蛋白水平的调控作用。利用RIP实验验证IGF2BP2与靶基因的结合。通过放线菌素D实验,验证IGF2BP2和hsa＿circ＿0001741对靶基因SERPINH1的m RNA稳定性的影响。5.靶基因SERPINH1在ccRCC中的表达以及功能研究:qRT-PCR检测SERPINH1在110对配对ccRCC组织及癌旁组织中的表达;通过合成SERPINH1的si RNA以及利用p CDH载体构建SERPINH1的过表达质粒,通过transwell实验,检测SERPINH1过表达或干扰对Caki-1和RCC-JF细胞迁移能力的影响。通过transwell回复实验验证hsa＿circ＿0001741是否通过SERPINH1影响肿瘤细胞的迁移。Western blot实验检测SERPINH1对SNAIL和SLUG表达的调控作用。第四部分:上皮细胞剪接调节蛋白1（Epithelial splicing regulatory protein 1,ESRP1）促进hsa＿circ＿0001741成环的机制探索。1.设计环状RNA成环相关的RNA结合蛋白的si RNA,在细胞中干扰其表达后检测hsa＿circ＿0001741的表达,筛选出能影响hsa＿circ＿0001741表达的RNA结合蛋白。2.qRT-PCR检测ESRP1在110对配对ccRCC组织及癌旁组织中的表达,并分析hsa＿circ＿0001741与ESRP1表达的相关性。3.预测ESRP1与hsa＿circ＿0001741侧翼内含子区的结合位点（GGT富集区）;通过RIP实验,验证ESRP1在hsa＿circ＿0001741上的结合位点。研究结果第一部分:ccRCC中环状RNA hsa＿circ＿0001741的筛选、表达分析及其与临床病理特征的关系。1.根据芯片分析结果,我们在15对ccRCC组织中验证候选的circ RNA,根据比较fold change值发现hsa＿circ＿0001741在ccRCC中的表达差异倍数最大（fold change=0.16,P＜0.01）。随后,在大样本的ccRCC组织（n=110）中验证发现hsa＿circ＿0001741在ccRCC中显著性低表达且与肿瘤远端转移、WHO/ISUP分级和肿瘤大小相关。此外,hsa＿circ＿0001741在临床组织中的表达与Ki67水平呈负相关。但是,其亲本基因TNPO3在ccRCC中的表达没有显著差异。2.Sanger测序证实PCR产物跨hsa＿circ＿0001741剪接接口;oligo d T实验证明hsa＿circ＿0001741无poly A尾;且hsa＿circ＿0001741较线性TNPO3更耐RNase R消化,在细胞内具有长于线性TNPO3的半衰期。Hsa＿circ＿0001741主要定位在细胞质中。第二部分:hsa＿circ＿0001741体内外抑制ccRCC增殖和转移的作用研究。1.干扰hsa＿circ＿0001741后,ccRCC细胞的增殖和迁移能力显著增强,反之,过表达hsa＿circ＿0001741后,细胞增殖和迁移能力显著减弱。hsa＿circ＿0001741可负向调控SNAIL和SLUG。2.在裸鼠皮下成瘤模型中,稳定干扰hsa＿circ＿0001741后,小鼠肿瘤体积显著大于对照组;腹腔播散模型中,与对照组相比稳定干扰hsa＿circ＿0001741后肿瘤腹腔播散能力显著增强;尾静脉肺转移模型中,稳定干扰hsa＿circ＿0001741后,小鼠肺部转移结节数量显著多于对照组。第三部分:hsa＿circ＿0001741通过结合IGF2BP2,协同影响SERPINH1的m RNA稳定性,抑制ccRCC细胞迁移的机制研究。1.双荧光素酶实验和RNA pull-down实验证实,hsa＿circ＿0001741与候选micro RNA互作可能性较低,且circ RNADb网站上预测出hsa＿circ＿0001741翻译潜能较低。而Starbase网站预测发现hsa＿circ＿0001741具有与RNA结合蛋白互作的可能。2.RNA pull down实验证实,hsa＿circ＿0001741能下拉IGF2BP2;IGF2BP2的RIP实验证实IGF2BP2能结合hsa＿circ＿0001741;且hsa＿circ＿0001741主要结合在IGF2BP2的1～157aa上;FISH-IF实验证实hsa＿circ＿0001741与IGF2BP2存在共定位,上述结果提示二者在ccRCC中存在直接结合作用。3.qRT-PCR、western blot和IHC实验证实,IGF2BP2的m RNA和蛋白水平均在ccRCC中显著性低表达;干扰IGF2BP2后,显著促进ccRCC细胞的迁移能力;反之,过表达IGF2BP2后,显著抑制ccRCC细胞的迁移能力。回复实验表明hsa＿circ＿0001741可能通过结合IGF2BP2,抑制ccRCC细胞的迁移。4.通过测序结果分析筛选出一系列候选靶基因,最终找到能显著被hsa＿circ＿0001741及IGF2BP2调控的靶基因SERPINH1。hsa＿circ＿0001741及IGF2BP2均可负向调控SERPINH1的m RNA及蛋白表达。回复实验证实,hsa＿circ＿0001741对靶基因的调控作用是可能通过IGF2BP2介导的。干扰IGF2BP2的RIP实验进一步证实,IGF2BP2能与SERPINH1的m RNA结合。稳定性实验证实,IGF2BP2和hsa＿circ＿0001741可抑制靶基因SERPINH1的m RNA稳定性。上述结果说明hsa＿circ＿0001741和IGF2BP2通过影响靶基因m RNA稳定性,进而抑制SERPINH1的表达。5.qRT-PCR结果证实,SERPINH1在ccRCC中显著性上调;干扰SERPINH1后,ccRCC细胞迁移能力显著下调;相反,过表达SERPINH1后,细胞迁移能力上调。回复实验证明,hsa＿circ＿0001741对ccRCC细胞的迁移作用可能是通过SERPINH1所介导的。此外,SERPINH1可调控SNAIL和SLUG的表达,且干扰hsa＿circ＿0001741对SNAIL和SLUG的调控作用可被干扰SERPINH1所回复。第四部分:ESRP1促进hsa＿circ＿0001741成环的机制探索。1.干扰ESRP1后,hsa＿circ＿0001741的表达明显下调。2.qRT-PCR结果显示,ESRP1在110对ccRCC组织中表达显著性下调,且ESRP1和hsa＿circ＿0001741在ccRCC中的表达呈正相关。3.RIP实验结果表明,ESRP1可结合在hsa＿circ＿0001741的侧翼内含子上。研究结论本研究系统地筛选了ccRCC中差异表达的circ RNA,通过实验证实hsa＿circ＿0001741在ccRCC中显著性低表达,且与肿瘤远端转移、WHO/ISUP分级和肿瘤大小紧密相关,在临床组织中hsa＿circ＿0001741的表达与Ki67呈负相关。体内外实验证实,hsa＿circ＿0001741能显著抑制ccRCC的转移和增殖。机制上,hsa＿circ＿0001741能直接结合IGF2BP2蛋白,协同抑制SERPINH1的m RNA稳定性,下调SERPINH1的表达水平,进而抑制ccRCC转移。此外,ESRP1可能与hsa＿circ＿0001741的生物形成相关。总之,本研究揭示了一个新的hsa＿circ＿0001741/IGF2BP2/SERPINH1作用轴,发挥着抑制ccRCC细胞迁移的作用,可作为ccRCC治疗的潜在靶点。