前言：　　早产是导致围产儿发病及死亡的主要原因。统计数据显示，早产在中国的发生率占分娩总数的5-15％。早产导致的围产儿死亡率占70％以上，且存活早产儿可能并发各种严重疾患，如呼吸窘迫综合征、脑瘫、颅内出血、早产性视网膜病变等。早产的发生主要是由于子宫提早收缩，而子宫的收缩性是由肌细胞内的游离钙离子浓度决定的。因此，研究子宫肌细胞内钙离子浓度变化的调控机理，对于最终阐明早产的发病机制具有重要意义。　　电压门控钙离子通道(voltage-gated calcium channels，VGCCs)是位于细胞膜的跨膜异源多聚体蛋白质，其开、关主要受电压控制。VGCCs负责胞外钙离子运输到胞内，可分为L、P/Q、N、R、T型。VGCCs是由多种亚基组成的复合物，包括α1、β、α2/δ、γ等。α1为钙通道的核心，由它组成亲水孔道调控Ca2+内流。α1亚基又分为10个亚单位，不同α1亚单位组成不同亚型钙通道。子宫平滑肌上的VGCCs主要为L和T型，编码T型钙通道的α1亚单位为α1G(Cav3.1)、α1H(Cav3.2)、α1I(Cav3.3)。钙离子通道抑制剂，如心痛定(nifedipine)等目前已在临床上用于治疗早产。但心痛定等抑制剂主要是针对L型钙离子通道的，T型钙离子通道是否也在感染引起的早产中起作用，目前仍然不是很清楚。　　本课题拟采用腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的方法建立小鼠早产动物模型，运用实时定量PCR、Western blot、免疫组化等实验技术手段研究T型钙离子通道在早产小鼠中的表达情况，探讨T型钙离子通道在感染引起的早产中的作用，通过RNA干扰和抑制剂干预等方法研究子宫平滑肌细胞调控T型钙离子通道表达及活性的分子机制。　　方法：　　一.小鼠早产模型建立及钙通道拮抗剂抑制小鼠早产的效果观察　　1.建立小鼠早产模型　　将孕鼠随机分为LPS组、NS组及正常对照组。孕15d时，给孕鼠腹腔注射LPS盐溶液及同体积生理盐水.早于19天分娩者定为早产。正常对照组不予任何处理。　　2.钙通道拮抗剂抑制小鼠早产的效果观察　　孕15天孕鼠给予30μlLPS后，1小时后分别给予不同剂量NNC55-0396和nifedipine，3小时后重复给药，共4次。观察小鼠分娩时间并计算早产率。　　二.LPS对小鼠子宫平滑肌中T型钙通道蛋白表达及调控机制　　1.利用real-time PCR、IHC、western-blot等检测LPS组、NS组及正常对照组小鼠子宫平滑肌组织中T型钙通道不同亚型的表达情况。　　2.小鼠子宫平滑肌细胞的分离、培养及鉴定:取孕15天C57BL/6J小鼠子宫平滑肌组织，置入无菌培养皿中，用生理盐水反复冲洗约2～3次，弃除纤维结缔组织，移入5ml的小烧杯中剪碎，然后用胰酶及胶原酶Ⅰ消化法培养;根据成纤维细胞与平滑肌细胞贴壁时间差异，对细胞进行纯化2-3次。纯化后，用SMA行免疫组化鉴定。　　3.细胞分为下述三组:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组。正常对照组细胞按常规培养方式培养，不进行任何处理。LPS处理组细胞，细胞培养基中加入LPS(2μg/ml)，于细胞孵育6、12、24h后收集细胞检测。生理盐水组细胞加入相同体积的生理盐水。实时定量PCR和Western blot检测上述三组细胞中Cav3.1、Cav3.2的表达量。根据实验结果选取最佳浓度及时间点。Western的排版顺序为:　　1）正常对照组6h、LPS处理组6h、生理盐水组6h、正常对照组12h、LPS处理组12h、生理盐水组12h;　　2）正常对照组24h、LPS处理组24h、生理盐水组24h。进行相关的细胞培养，培养方法同上。　　4.进行相关的细胞培养，培养方法同上。Western blot检测正常对照组、LPS处理组、生理盐水组细胞中NF-κB p65、ET-1的表达情况。Western的排版顺序为:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组。　　5.构建NF-κB p65 shRNA细胞系，细胞分为:未转染对照组、shRNA-p65组、shRNA-Negative control组。实时定量PCR和Western blot鉴定干扰效果。Western blot的排版顺序为:未转染对照组、shRNA-p65组、shRNA-Negative control组。　　6.Western blot检测:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组、LPS+NF-κB抑制剂组、LPS+DMSO对照组、LPS+shRNA-p65组、LPS+shRNA-Negative control组细胞中Cav3.1、Cav3.2、ET-1蛋白的表达水平。LPS+NF-κB抑制剂组，细胞培养基中加入LPS和NF-κB抑制剂BAY11-7082，孵育一定时间后收集细胞。Western的排版顺序为:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组、LPS+NF-κB抑制剂组、LPS+DMSO对照组、LPS+shRNA-p65组、LPS+shRNA-Negative control组。　　7.进行相关的细胞培养，培养方法同上。Western blot检测:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组、ET-1处理组、LPS+ET-1处理组细胞中Cav3.1、Cav3.2蛋白的表达水平。ET-1处理组、LPS+ET-1处理组中加入ET-1重组蛋白，建议浓度范围5-100nM，最适浓度根据实验结果而定。Western的排版顺序为:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组、ET-1处理组、LPS+ET-1处理组、ET-1受体拮抗剂处理组、LPS+ET-1受体拮抗剂处理组。　　三.LPS对小鼠子宫平滑肌细胞内钙离子浓度影响及调控机理　　1.Fluo-3AM(钙离子荧光探针)试剂盒检测下述六组:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组、LPS+NNC55-0396抑制剂组、LPS+Nifedipine(L型钙通道拮抗剂)+ThaPsigargin（肌浆网钙泵抑制剂，TG）组、LPS+Nifedipine+TG+NNC55-0396组细胞内钙离子浓度。正常对照组、LPS处理组、生理盐水组的处理方式与前述相同。后三组，细胞培养基中加入LPS和NNC55-0396抑制剂/Nifedipine/ThaPsigargin后孵育一定时间（具体时间根据上述第2步的实验结果而定）收集细胞，用于检测胞内钙离子浓度。NNC55-0396抑制剂的建议使用浓度为5μM[13]，Nifedipine建议浓度100μM，ThaPsigargin建议浓度1-μM，最适浓度根据实验结果而定。　　2.Fluo-3AM(钙离子荧光探针)试剂盒检测:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组、LPS+NF-κB抑制剂组、LPS+DMSO对照组、LPS+Nifedipine+ThaPsigargin组、LPS+NF-κB抑制剂+Nifedipine+ThaPsigargin组、LPS+NF-κB抑制剂+Nifedipine+ThaPsigargin+NNC55-0396、LPS+shRNA-p65、LPS+shRNA-Negative control组、LPS+shRNA-p65+Nifedipine+ThaPsigargin组、LPS+shRNA-p65+Nifedipine+TG+NNC55-0396组细胞内钙离子浓度。　　3.进行相关的细胞培养，培养方法同上。Fluo-3AM(钙离子荧光探针)试剂盒检测:正常对照组、LPS处理组、生理盐水组、LPS+Nifedipine+TG组、ET-1处理组、ET-1+Nifedipine+TG组、ET-1+Nifedipine+TG+NNC55-0396组、LPS+ET-1+Nifedipine+TG组、LPS+ET-1受体拮抗剂+Nifedipine+TG+NNC55-0396组细胞内钙离子浓度。　　结果：　　（一）:利用小鼠腹腔注射LPS建立早产模型。发现LPS组均在用药后24小时发生分娩，而正常对照组及生理盐水组同时间无一例分娩。小鼠腹腔注射LPS3小时后给予不同亚型的钙通道拮抗剂，发现T-型钙通道拮抗剂可明显抑制小鼠早产的发生，效果明显优于心痛定。　　（二）:我们利用Taqman实时定量RT-PCR方法、免疫组化及western-blot等方法检测T-型钙通道在不同组别小鼠子宫平滑肌组织中的表达变化，发现T-型钙通道主要表达亚型为Cav3.1和Cav3.2，Cav3.3几乎不表达，T-型钙通道主要表达于子宫肌层、内膜及腺体;同正常对照组及生理盐水组比较，Cav3.1和Cav3.2在早产组(LPS)表达明显升高，差异有统计学意义。　　进行孕鼠原代子宫平滑肌细胞培养，用LPS和ET-1干预细胞，24小时后钙通道表达上调最为明显。LPS和ET-1均可激活NF-κB。NF-κB干扰后，再用LPS干预子宫平滑肌细胞，T-型钙通道表达无明显变化。　　（三）:Fluo-3AM(钙离子荧光探针)试剂盒检测细胞内钙离子浓度，LPS和ET-1均可明显促进钙内流。在拮抗细胞内钙通道及L-型钙通道拮抗后，用LPS和ET-1干预，细胞内钙浓度仍可明显升高，而细胞内钙通道及T-型钙通道拮抗后，再用LPS和ET-1刺激，细胞内钙浓度升高相对小。　　结论：　　T-型钙通道拮抗剂NNC55-0396可有效抑制LPS诱导的小鼠早产的发生。T-型钙通道参与子LPS诱导的小鼠早产的发生，一方面通过表达上调，其机制为LPS激活NF-κB后直接调控T-型钙通道转录，并且LPS激活NF-κB后可促进子宫平滑肌细胞产生ET-1，ET-1又可上调T-型钙通道表达;另一方面通过活性改变，LPS和ET-1均可激活T-型钙通道，促进钙内流。