多酚类化合物属于植物次生代谢物,是人类膳食中最丰富的抗氧化剂来源,具有抗炎、神经保护、心脏保护、癌症预防、抗肥胖等多种生物学功效。膳食中的多酚类化合物对人体的健康作用实际上取决于其加工过程。热处理是食品加工与保藏中最广泛使用的方法。对于富含膳食多酚的食品,热加工可能导致食品营养价值的改变。将益于人体健康的多酚类化合物作为添加剂添加到食品中,可能引发一系列复杂的化学反应和生物活性的改变,进而对食品的最终品质及人体健康功效产生影响。然而,目前这方面的研究未得到应有的重视,很少有研究关注多酚在食品加工过程中的量质变化规律及生物活性变化,及由此引发的食品健康价值的改变;且缺乏不同结构多酚在食品体系中的比较。黄酮类化合物是自然界,尤其是植物界分布较广泛的一大类天然多酚类化合物,几乎占人类膳食多酚摄入的2/3,广泛存在于天然食品中。柚皮素是典型黄酮类多酚,而其结构类似物,包括糖苷形式柚皮苷,甲氧基取代橙皮素和多羟基取代二氢杨梅素同样是人类膳食中主要的天然成分。烘焙食品作为常见饮食有着广大的消费者群体,且烘焙食品在加工过程中产生的某些美拉德产物如晚期糖基化终末产物对人体健康有潜在危害。本课题旨在研究上述典型代表性黄酮类多酚的热响应特性,对美拉德模式反应体系及烘焙模型体系特征性美拉德产物的影响,特别是对晚期糖基化终末产物(AGEs)形成的影响;并就其对AGEs诱导的氧化应激和炎症的作用对比及可能的机制进行探讨。主要研究方法及结果如下:1.选取中性氨基酸,芳香族氨基酸,含硫氨基酸三类典型氨基酸中的代表,分别为甘氨酸,苯丙氨酸和半胱氨酸,在不同pH(4,7,10)条件下与葡萄糖构建美拉德化学模式反应体系,终浓度控制50 mM,140℃油浴60 min,研究柚皮素(10 mM)对模式反应体系中特征性美拉德反应产物的作用规律。通过MMSE-GC-MS结合电子鼻技术,我们发现柚皮素对三组模式体系中特征性美拉德挥发性成分如吡嗪类、呋喃类、噻吩类化合物等都有显著影响。在中性条件下,3组美拉德模式反应总体气味物质均因柚皮素添加而显著降低,且挥发物的种类及其含量变化依模型种类不同而各异。此外,光谱分析及TEAC法结果显示柚皮素可增加甘氨酸模型体系的褐变强度,抑制模式反应体系中荧光性AGEs的形成,提高模式反应体系的抗氧化活性。HPLC-DAD结果显示柚皮素140℃,60min热处理后未发生热降解及抗氧化能力损失,而在甘氨酸模式体系中柚皮素含量随着时间的推移呈指数型递减。2.为进一步考察柚皮素在美拉德反应中的作用规律,构建面包模型,并用酶联免疫法,LC-MS/MS及荧光分析法等,就其对食品体系中的特征性美拉德反应产物影响的情况进行考察。面包作为典型烘焙主食,除挥发性成分外,某些种类的美拉德反应产物对人类健康的危害不容忽视。随着面包中柚皮素含量的增加(0.25~1%w/w),面包皮中的羧甲基赖氨酸CML和总荧光性AGEs的形成显著受到了抑制,分别为19.67~54.27%和11.79~35.19%。此外,0.25%w/w柚皮素的强化显著抑制了面包皮中丙烯酰胺的形成(35.85%)。3.鉴于柚皮素对美拉德模式体系生物活性的积极作用,也进一步就抗氧化活性及抗菌活性两种面包模型典型的生物活性评价指标来进行考察。研究发现面包烘焙过程会降低柚皮素的抗氧化能力,但其强化仍可以显著增强面包芯的抗氧化活性,对ABTS~+自由基清除能力随强化水平的增加而显著提高。此外,菌落总数结果显示添加了柚皮素后面包的抗菌活性提高,且在一定的添加范围内与抗氧化活性作用趋势相同,进一步映证了柚皮素的添加可以提高面包模型的生物活性,且电子眼,质构分析和低场核磁分析结果显示柚皮素的适当强化不会对面包品质产生不良影响。液相定量分析显示柚皮素在面包皮中损失了31%,参与了美拉德反应,而面包芯中有91%的高保留率。4.为了进一步研究柚皮素及其他典型食源性天然黄酮类多酚在烘焙模型中的作用,另构建新型代表性高不饱和脂肪酸体系加以考察。研究发现低强化量0.25%w/w柚皮素对新型代表性高不饱和脂肪酸体系中的特征性美拉德有害产物羧甲基赖氨酸没有抑制作用,但是对荧光性AGEs的抑制能力,及体系抗氧化活性的增强与面包体系相近,进一步映证了柚皮素对烘焙体系特征性美拉德产物有显著影响。同时,又进一步选择了柚皮素的结构衍生物柚皮苷,橙皮素和二氢杨梅素三个典型食源性天然黄酮进行对比研究,研究发现四种黄酮对脂质过氧化产物丙二醛都有显著抑制,除柚皮苷外,对蛋白羰基化和荧光性晚期糖基化终产物都有显著降低,对体系抗氧化活性的增强都有显著提高。其中二氢杨梅素在降低模型体系中脂质和蛋白质氧化,和羧甲基赖氨酸,提高增强抗氧化活性方面表现出四种黄酮中最佳的效果。为了研究上述化学和生物活性变化是由实验黄酮热稳定性或参与美拉德反应引起的,进一步利用HPLC定量分析,总酚测定,TEAC法及微生物实验加以考察。研究结果表明,当四种黄酮类多酚单独受热处理(180℃,20分钟),柚皮素和橙皮素未降解,且对革兰氏阴性/阳性菌的抑制和对ABTS~+自由基的清除能力未发生显著变化;柚皮苷和二氢杨梅素分别降解了约28.66%及10.18%且亦有相吻合的抗氧化和抗菌活性作用趋势。而在新型代表性高不饱和脂肪酸模型中180℃烘焙20分钟,柚皮素、橙皮素均有相对较高的保留率,分别为73.5,84.8%,但二氢杨梅素仅余36.1%并伴随体系亮度下降。5.食源性AGEs在体内的积累可诱发氧化应激和炎症应激,继而引发慢性病。上述代表性黄酮类多酚可降低AGEs的形成,为了进一步考察是否可以降低AGEs诱导的毒性,选取RAW264.7细胞系,通过细胞培养,细胞毒实验,DCFH-DA荧光法及qPCR实验等方法,进一步就柚皮素及其结构类似物对AGEs诱导的氧化压力和炎症进行作用对比考察。结果显示,柚皮素可以显著减少AGEs诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的活性氧(ROS)以及典型炎性介质IL-1β、IL-6、COX-2的基因表达。进一步地,以柚皮素为阳性对照,进行其结构类似物的构效关系考察,研究发现在25μM作用浓度下,二氢杨梅素和柚皮苷对ROS的产生有较强的抑制作用,但在25μM及40μM浓度下对炎性介质的基因表达几乎无显著作用。而橙皮素同柚皮素在25μM下既可降低AGEs诱导的ROS产生,又对TNF-α、IL-1β、IL–6、MCP-1、COX–2和iNOS等多组炎症介质的基因表达有显著的抑制作用。6.最后,就AGEs刺激的巨噬细胞进行高通量转录组学解析,并考察代表性黄酮橙皮素可能的保护机制。通过对差异表达基因的分析及相应的GO和KEGG富集,发现AGEs可以对多种基本的生物过程,细胞组成和分子功能产生影响,而橙皮素在炎症、免疫方面起到调节作用。结合通路富集结果及免疫印迹和免疫荧光进行实验验证,发现橙皮素的抗AGEs诱导的炎症的作用,可能与抑制MAPK,JAK,NF-κB相关通路的激活有关。进一步地,针对高通量测序全部表达谱数据,利用MSigDB数据库全部基因集进行GSEA基因富集分析,发现在AGEs模型组与对照组和橙皮素治疗组与AGEs模型组的比较中,与干扰素相关的基因集高频出现且具有统计学意义和生物学意义,并进一步筛选出了14个典型基因集从基因层面做深度考察,最终筛选出了与AGEs的损伤作用及橙皮素的保护作用相关的ZBP1,ISG20,ISG15,USP18,DDX60,SAMHD1,SP100,XAF1,MYD88,SAMD9L,IF135,IF144,IRF7,DHX58,SP110,EPST11,WARS,STAT1,GBP4,CXCL10,PARP12,TAP1,OAS2等23个关键基因。综上所述,本课题评价了四种典型代表性黄酮类多酚的热响应特性,对美拉德模式反应体系及烘焙模型体系特征性美拉德产物的影响,特别是对晚期糖基化终末产物形成及其诱导氧化压力和炎症的抑制作用。本论文工作对富含多酚食品的基础研究和新产品开发奠定理论基础。