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第一部分体内研究高血糖对肝内S1P/S1PRS系统的影响,并进一步研究激活的S1P-S1PR3信号通路对肝脏缺血再灌注损伤的影响目的:体内研究高血糖对S1P/S1PRS系统的影响,并进一步探索激活的S1P-S1PR3信号通路对高糖加重肝脏缺血再灌注损伤的影响。方法:招募肝脏良性疾病实行肝切除的糖尿病病人,并采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法构建高血糖小鼠模型。接着分别利用高血糖小鼠和正常小鼠建立70%肝脏缺血90分钟再灌注6,24h的动物模型,并用假手术组作为对照(shame组)。通过Quantitative RT-PCR(qRT-PCR),Western blot和ELISA方法检测S1P/S1PRS系统中各个分子在各组中的表达情况。根据检测情况,单独建立70%肝脏缺血90分钟再灌注后6h的动物模型,并于再灌注前分别对高血糖小鼠和正常小鼠腹腔注射S1PR3抑制剂CAY-10444(1mg/kg);我们在不同小组分别检测了小鼠ALT,AST,炎症基因表达及肝组织内炎症细胞浸润情况;并用qRT-PCR,Western blot以及免疫荧光等方法检测了与巨噬细胞M1/M2极化相关的表面分子和标志性通路。结果:与血糖正常者相比,糖尿病患者或者高血糖小鼠中S1P水平均明显增高。S1PR3,而不是S1PR1和S1PR2,在高血糖刺激下在肝组织和KCs中被特异性激活。S1PR3拮抗剂CAY-10444可以降低高血糖小鼠缺血再灌注后的肝脏酶学指标(ALT,AST),肝脏组织炎症浸润(巨噬细胞和中性粒细胞浸润)和血清促炎因子(TNF-α,IL-6)释放,从而减弱高血糖恶化的肝脏缺血再灌注损伤。qRT-PCR和Western blot结果还显示高血糖小鼠肝脏在缺血再灌注前后都表达较高水平的M1型巨噬细胞相关分子和低水平的M2型巨噬细胞相关分子;荧光双染实验进一步证实高血糖促进肝内巨噬细胞的M1(CD68/CD86)分化并抑制其M2(CD68/CD206)分化。更重要的是,CAY10444可以逆转上述高血糖调节的M1/M2极化,它能够促进肝脏内巨噬细胞的M2型极化并抑制巨噬细胞的M1型极化。结论:高血糖特异性激活了S1P-S1PR3信号通路,该激活的信号通路可能通过调控巨噬细胞的M1/M2极化增加炎症反应从而加重肝脏缺血再灌注损伤第二部分体外研究高糖对巨噬细胞内S1P-S1PR3信号通路的影响,并进一步探索S1P-S1PR3通路加重炎症反应的作用及机制目的:体外验证高血糖激活S1P-S1PR3信号轴,并进一步研究该通路是否通过调控巨噬细胞M1/M2极化加重炎症反应。方法:提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs),分别在低糖(LG)培养基(5mM)或高糖(HG)培养基(30 mM)的条件下将BMDMs培养分化7天,设为LG组和HG组;接着分别对两组加LPS(1ug/ml)刺激,设为HG+LPS组和LG+LPS组。最后我们采用S1PR3 siRNA和对照组(NS)siRNA分别对高糖BMDMs进行干扰转染,抑制S1PR3表达后加用LPS刺激,设为HG+LPS/S1PR3组和HG+LPS/NC组。我们分别于刺激后的0h,2h,6h,12h和24h收集上述各组细胞的细胞上清及细胞蛋白。用qRT-PCR,Western blot和ELISA等方法进一步研究高血糖激活的S1P-S1PR3信号通路对体外巨噬细胞炎症反应和巨噬细胞M1/M2极化的影响。结果:在体外,高血糖激活了骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)内的S1P-S1PR3信号通路。在加入LPS刺激后,高糖BMDMs内S1P-S1PR3轴激活更加明显;与低糖BMDMs相比,高糖BMDMs在LPS刺激后TNF-α和IL-6等促炎症因子分泌明显增加,而IL-10等抑炎因子明显下降;相比之下,S1PR3敲低的高糖BMDMs明显降低了TNF-α和IL-6等促炎症因子分泌,而IL-10等抑炎的分泌相对增加。同时S1PR3敲低的高糖BMDMs内STAT1活化(磷酸化)明显降低,但STAT3和STAT6的活化明显增加。结论:体外高糖同样激活了巨噬细胞内的S1P-S1PR3信号通路,S1P-S1PR3轴通过促进巨噬细胞的M1型极化并抑制M2极化加重体外巨噬细胞炎症反应。