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【研究背景及目的】原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)是指由肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤。肝细胞癌(以下简称肝癌)(hepatocellular carcinoma，HCC)是其中最常见的组织学类型，占肝脏肿瘤的80%~90%。肝癌的全球发病率逐年增长，在所有恶性肿瘤中位列第五，而其死亡率为第三位。尽管近年来肝癌的诊治已取得较大进展，但其预后仍不理想，临床迫切需要寻找新的治疗方案。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase cascades，MAPKs)是一类广泛存在于细胞内的高度保守的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要的信号转导系统。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulation kinases，ERKs)是其重要成员之一，参与了包括肝细胞在内的多种细胞的增殖、分化、凋亡等病理生理过程。有研究表明，ERK信号转导通路在HCC中过度活化，且ERK通路活化的HCC患者相对ERK表达阴性的患者预后更差，因此，抑制ERK的表达可能成为治疗肝癌的新靶点。本课题旨在探讨ERK1小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对大鼠肝癌细胞株生物学特性的影响及其可能的作用机制。【实验方法】一、检测人肝癌标本及大鼠肝癌细胞株中ERK1的表达（一）肝癌组织中ERK1表达选择12例人肝癌手术切除标本，以癌旁肝组织做为对照，免疫组化法检测ERK1表达及定位情况。在二乙基亚硝胺（diethylinitrosamine，DEN）诱导大鼠肝癌形成的过程中，取不同时间点大鼠肝组织，免疫组化法检测ERK表达及定位情况。（二）大鼠肝癌细胞株中ERK1表达培养大鼠肝癌细胞株RH-35及H4IIE，抽取总RNA，逆转录为cDNA，以正常大鼠原代肝细胞为对照，RT-PCR检测大鼠ERK1mRNA水平表达情况。二、重组复制缺陷型腺病毒AdshERK1构建、鉴定及扩增从pSuper质粒上双酶切得到ERK1shRNA目的片段，将目的片段与pShuttle-GFP-H1-neo质粒连接，获得穿梭质粒pShuttle-GFP-H1-shERK1，该质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后筛选获得pAdshERK1。Pac I酶酶切质粒pAdshERK1使其线性化后，转染293A细胞进行包装，获得腺病毒AdshERK1。以同样方法构建空白对照病毒AdshNC。用AdshERK1感染肝癌细胞H4IIE，Western blot方法检测细胞中ERK1蛋白水平表达。扩增高效表达ERK1siRNA的腺病毒AdshERK1和对照病毒AdshNC，测定病毒滴度，-80℃冰箱中保存。三、AdshERK1对大鼠肝癌细胞生物学效应的影响（一）AdshERK1对肿瘤细胞生长的影响1.细胞增殖实验将大鼠肝癌细胞株RH-35、H4IIE分至96孔板，设置AdshERK1感染组、对照病毒AdshNC感染组和空白对照组。Cell counting kit8(CCK8)法检测细胞在波长为450nm时的光密度值（OD值），连续检测6天，绘制生长曲线。2.克隆形成实验将感染腺病毒AdshERK1、AdshNC的RH-35、H4IIE细胞分至35mm细胞培养皿(400个细胞/皿)，当细胞分裂至肉眼可见的克隆时，用考马斯亮蓝染色，拍照并分析AdshERK1对肿瘤细胞克隆形成能力的影响。3.流式细胞仪测定细胞周期腺病毒AdshERK1、AdshNC感染大鼠肝癌细胞株RH-35、H4IIE，37℃CO2培养箱培养72h后，收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期变化。（二）AdshERK1对肿瘤细胞转移能力的影响1.划痕实验将大鼠肝癌细胞RH-35、H4IIE分至35mm细胞培养皿，待细胞密度达95%后，用200ul枪头在细胞单层上划痕，PBS洗掉脱落细胞，用腺病毒AdshERK1、AdshNC分别感染细胞，显微镜下观察AdshERK1对细胞迁移能力的影响。2.transwell迁移实验将RH-35、H4IIE细胞分至六孔板，分别感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后收集细胞种植于transwell小室，37℃CO2培养箱培养48h后，去除小室上层未迁移细胞，0.5%结晶紫溶液固定染色下层细胞，显微镜下观察，评估AdshERK1对肿瘤细胞迁移能力影响。3.重组基底膜侵袭实验将RH-35、H4IIE细胞分至六孔板，分别感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后收集细胞种植于包被有matrigel的transwell小室，37℃CO2培养箱培养48h后，去除小室上层未迁移细胞，结晶紫固定染色下层细胞，显微镜下观察，评估AdshERK1对肿瘤细胞侵袭能力影响。（三）AdshERK1对肿瘤细胞成瘤能力的影响将分别感染腺病毒AdshERK1、AdshNC的大鼠肝癌细胞H4IIE接种于裸鼠皮下，左右两侧分别为AdshERK1组、AdshNC组，每周两次观察肿瘤生长情况并测量大小，观察AdshERK1对大鼠肝肿瘤细胞成瘤性的影响。（四）AdshERK1对ERK1下游肿瘤相关基因表达的影响腺病毒AdshERK1、AdshNC感染大鼠肝癌细胞株RH-35、H4IIE72h、96h后收集细胞，RT-PCR法检测ERK1及其下游基因癌基因c-myc mRNA表达。四、统计学处理数据以X±SD表示，用SPSS11.0统计软件进行方差分析。P <0.05说明数据有统计学差异，P <0.01说明数据有明显的统计学差异。【实验结果】一、ERK1在肝癌组织及大鼠肝癌细胞中表达上调（一）肝癌组织中ERK1表达上调免疫组化显示，11例肝癌组织ERK1表达较其相应癌旁组织明显上调，另1例肝癌组织ERK1表达无明显差别。免疫组化显示，在DEN诱导大鼠肝癌模型中，随造模时间延长，大鼠肝脏中ERK表达逐渐升高。（二）大鼠肝癌细胞株中ERK1表达上调Real time RT-PCR结果显示，在大鼠肝癌细胞株RH-35、H4IIE中ERK1表达均显著上调（RH-35，H4IIE vs normal，P<0.01）。二、成功构建重组复制缺陷型腺病毒AdshERK1用293A细胞包装的腺病毒AdshERK1感染肝癌细胞H4IIE，Western blot法检测ERK1蛋白表达，结果显示其表达明显下调，表明腺病毒AdshERK1构建成功。三、AdshERK1对大鼠肝癌细胞生物学效应的影响（一）AdshERK1抑制肿瘤细胞增殖及克隆形成能力1.AdshERK1抑制肿瘤细胞增殖能力将AdshERK1、AdshNC感染RH-35或H4IIE，CCK8法检测细胞在波长450nm时的光密度值（OD值），连续检测6天，绘制生长曲线。结果示AdshERK1显著抑制大鼠肝癌细胞增殖，且该抑制作用呈时间依赖性。AdshERK1感染6天时，RH-35细胞中AdshERK1对细胞的生长抑制率达37%（P <0.01，Student’s t test）；H4IIE细胞中，AdshERK1对细胞的生长抑制率达46%（P <0.05，Student’s t test）。2.AdshERK1抑制肿瘤细胞克隆形成能力将感染AdshERK1、AdshNC病毒的RH-35或H4IIE细胞分至35mm细胞培养皿，AdshERK1感染10天左右染色固定细胞，观察两组克隆数量差别，结果示腺病毒AdshERK1可以显著减弱大鼠肝癌细胞的克隆形成能力（P <0.05，Student’s t test）。3.AdshERK1引起细胞周期阻滞流式细胞仪检测细胞周期，结果示AdshERK1使大鼠肝癌细胞的S期细胞数明显减少，提示细胞周期阻滞在G0/G1期。RH-35细胞中，AdshERK1组G0/G1时相细胞较AdshNC组显著增多（89.57%±1.26%vs76.77%±0.93%，P <0.01），S期细胞百分数较AdshNC组显著减少（4.39%±0.85%vs18.55%±4.80%，P <0.01）；H4IIE细胞中，AdshERK1组G0/G1时相细胞较AdshNC组增多（61.18%±0.29%vs56.61%±0.54%），无统计学差异，S期细胞百分数较AdshNC组减少（24.29%±0.10%vs29.04%±0.59%），无统计学差异。（二）AdshERK1抑制肿瘤细胞迁移与侵袭能力1.AdshERK1抑制肿瘤细胞迁移能力将大鼠肝癌细胞RH-35、H4IIE分至35mm细胞培养皿，用200μl枪头在细胞单层上划痕，显微镜下观察AdshERK1对细胞迁移能力的影响。结果示AdshERK1可显著抑制细胞的迁移能力（P <0.05）。将RH-35、H4IIE细胞分至六孔板，分别感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后种植于transwell小室，48h后去除小室上层未迁移细胞，0.5%结晶紫溶液固定染色下层细胞，显微镜下观察小室下层迁移细胞数量。结果示AdshERK1组细胞的迁移能力受到显著抑制（P <0.01）。2.AdshERK1抑制肿瘤细胞侵袭能力将RH-35、H4IIE细胞分至六孔板，分别感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后种植于包被有matrigel的transwell小室，48h后结晶紫固定染色下层细胞，显微镜下观察小室下层迁移细胞数量。结果示AdshERK1组细胞的侵袭能力受到显著抑制（P <0.01）。（三）AdshERK1显著抑制肿瘤细胞成瘤能力将分别感染腺病毒AdshERK1、AdshNC的大鼠肝癌细胞H4IIE接种于裸鼠皮下，每周观察肿瘤生长情况两次并测量大小。细胞感染AdshNC后7d皮下即可触及肿瘤，21d后6只小鼠均可触及肿瘤生长；AdshERK1组接种10d后皮下可触及肿瘤，21d后3/6只小鼠可触及肿瘤生长，肿瘤重量较AdshNC组显著减小（P <0.01）。（四）AdshERK1对ERK1下游肿瘤相关基因表达的影响RT-PCR结果示RH-35、H4IIE细胞感染AdshERK172h及96h后ERK1及其下游癌基因c-myc的表达显著下调（RH-35，P <0.01；H4IIE，P <0.01）【结论】一、ERK1在肝癌组织及大鼠肝癌细胞株中表达上调。二、构建的腺病毒AdshERK1可显著抑制H4IIE细胞ERK1蛋白水平表达。三、AdshERK1抑制大鼠肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、转移能力及成瘤能力。AdshERK1对大鼠肝癌细胞生物学特性影响可能与抑制其下游肿瘤相关基因表达有关。