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单克隆抗体因其与抗原结合具有高度特异性与强亲和力,已成为抗体药物研发的主要类型。但随着研究的深入,它的诸多缺陷如与抗原结合次数有限、带来非预期的抗体清除效应和抗原累积效应等缺陷也浮出水面。研究热点不再局限于天然抗体的筛选,而是通过改造提升抗体药物的药效。利用基因工程改造以提高抗体与抗原的结合次数,延长抗体半衰期是近年来研究的重点。本研究拟通过对两株抗HBV抗体进行pH依赖抗原结合和Fc的双重改造,获得能够延长体内半衰期的清道夫抗体。主要研究内容包括以下四部分:第一,pH依赖抗原结合改造抗体库的构建、筛选与检测。本研究综合三维结构模拟及合理库容的考虑,最终确定了24或26个组氨酸突变位点。利用噬菌体展示构建了氨基酸组合突变噬菌体抗体库,经过3或4轮筛选获得共5株可变区改造抗体。在pH 7.4时,这5株噬菌体抗体能保持与亲本相当的强抗原结合活性,在pH 6.0时则与抗原呈现弱结合的特点。第二,抗体的表达、纯化和功能评估。构建真核表达载体,在FreeStyleTM 293F细胞中表达5株改造抗体并纯化,进行性质鉴定及功能评估。5株抗体仍能保持中性环境下与亲本相当的抗原结合活性,但酸性环境下与抗原弱结合。利用HBV转基因鼠,对pH依赖抗原结合改造抗体进行体内效果评估。pH依赖抗原结合变体在保持与亲本相当抗原清除效果的同时,较亲本有0.5倍动物体内抗原抑制作用时间的延长。第三,清道夫抗体的构建及细胞水平的功能评估。1)将两株HBV清除效果好的pH改造改造变体进行Fc区段的改造,即V4突变(M252Y、N286E、N434Y,加强中性条件下与hFcRn亲和力)。利用稳定表达带EGFP的hFcRn的MDCK细胞株进行体外细胞吞噬效果评估,结果和亲本抗体相比,带有V4改造的清道夫抗体能显著促进MDCK细胞吞噬HBsAg。2)将一株pH依赖抗原结合改造抗体进行Fc区段的改造,即DY突变(K326D、D328Y,加强中性条件下与mFcγRⅡ亲和力),利用 THP-1和鼠原代巨噬细胞进行体外细胞吞噬效果评估。带有DY改造的清道夫抗体较亲本可以明显促进两种巨噬细胞吞噬HBsAg。第四,清道夫抗体在动物模型中的功能评估。利用HBV腺相关病毒感染稳定表达hFcRn的转基因小鼠,HBV转基因鼠,评估清道夫抗体的功能。结果显示带V4突变的清道夫抗体具有与亲本抗体相同的抗原清除效果,同时具有更长的抑制时间(约1倍以上的延长)。带DY突变的清道夫抗体在抗原清除能力上比亲本抗体强一个数量级以上且有12 d抗原抑制时间的延长。总之,本研究获得的清道夫抗体较亲本抗体有显著加强了抗原清除效率和延长了抗原抑制时间,具有成为HBV二代治疗性抗体的潜力,对慢乙肝的治疗具有深远的影响。