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蛋白质/蛋白质及蛋白质/DNA的相互作用对于阐明生命活动的分子机制有重要的意义。我们实验室近年来初步建立了用AFM单分子力谱方法研究免疫球蛋白E(IgE)/aptamer和植物转录因子ZmDREB1A/DNA元件的相互作用。本论文在此工作基础上进一步发展了AFM单分子力谱方法,在AFM针尖和蛋白质之间引入聚合物PEG链来区分特异性与非特异性相互作用,并在测力基础上发展动力学力谱,将动力学力谱应用于研究aptamer/蛋白质复合物的解离过程;进一步研究了AFM测得的转录因子与DNA元件单分子相互作用力大小与转录因子的基因激活能力的关系。更重要的是,将AFM单分子力谱应用于活细胞水平蛋白质/蛋白质之间的相互作用研究,成功地在活细胞上测定了重要蛋白质配体/受体的相互作用力。本论文具体工作如下:
首先,在针尖的修饰过程中引入聚合物PEG链,将分子间的特异相互作用与针尖/基底的非特异性相互作用区分开来,用单分子对法直接测定单对分子间相互作用力。本文作者在此基础上研究了IgE与其两个aptamer及α-凝血酶与其aptamer的相互作用,并用动力学力谱研究了不同加载速率下三对蛋白质/aptamer的相互作用,得到了蛋白质/aptamer解离过程的Bell模型参数和能垒图,并与抗体/抗原在同样加载速率范围内的能垒图进行比较,发现它们从结合态到解离态经过的途径不同,蛋白质/aptamer复合物的解离过程需要跨越两个能垒,经过一个中间态达到解离终态,而抗体/抗原则只需跨越一个能垒直接到达解离终态。该结果为研究蛋白质/aptamer相互作用机理提供了新信息。
其次,用AFM单分子力谱研究了三种转录因子(TINY、OsDEBF、TSHl)与其DNA脱水响应元件DRE和乙烯应答元件ERE的相互作用,表明转录因子TINY和OsDEBF均能与两类元件有效结合,而TSH1则只与ERE元件结合,不与DRE元件结合。另外以TINY蛋白为例研究了AFM测定的单分子相互作用力与转录因子对下游基因激活能力的关系。研究发现,单分子作用力强的蛋白对下游基因的激活能力强,作用力弱的蛋白对下游基因的激活能力弱。这些结果在植物转录因子的功能研究方面有着重要的意义。
最后,发展了活细胞上的单分子力谱法。用AFM单分子力谱法在活细胞水平研究了TGF-β信号通路中的重要蛋白质TGF-β与其受体的相互作用,测定了有无I型受体存在下,II型受体与配体TGF-β的单分子力谱,并将有无I型受体的动力学力谱进行比较。结果表明I型受体的介入增强了TGF-β与其II型受体的相互作用,即在活细胞表面测得的TGF-β1与TβRI/TpRII复合物的作用力强于TGF-β与TβRII的相互作用力,说明在活细胞上TGF-β的两种受体能协同与配体作用。另外动力学力谱表明I型受体介入前后复合物的解离途径不同,无I型受体存在时,复合物解离只需跨越一个能垒到达解离终态,而有I型受体存在时,复合物的解离需要跨越两个能垒、经过一个中间态到达终态。这是首次用单分子力谱在活细胞水平研究生长因子和生长因子受体相互作用。这为进一步理解TGF-β信号转导的分子机理提供了新方法。此外还利用活细胞上单分子力谱法研究了细胞黏附蛋白质配体ICAM-1与其受体Mac-1的相互作用。发现在静息状态下Mac-1对ICAM-1有一定的结合,当Mac-1被活化后,其对ICAM-1的结合力增大。通过比较活化的野生型Mac-1与Mac-1的几个不同突变体和ICAM-1相互作用的单分子力谱,本文作者推测Mac-1活化后亲和力增高是由α亚基I结构域的α7螺旋的下移控制的。这些结果有助于进一步认识Mac-1活化的分子基础。