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目的：1.临床研究采用前瞻性随机对照研究的方法,纳入晚期肝细胞癌患者。治疗组给与健脾理气抑瘤方联合CIK细胞治疗,对照组给与辨证中药联合CIK细胞治疗。观察两组的临床疗效,并通过文献对照研究,探讨中医药联合CIK细胞治疗晚期肝细胞癌的作用。2.实验研究采用Bel-7402肝癌细胞株进行体外研究,探讨①健脾理气抑瘤方对Bel-7402细胞增殖的抑制作用及其相关机制、作用靶点；②研究健脾理气抑瘤方联合CIK细胞对Bel-7402细胞增殖的抑制作用,了解两者是否存在协同作用,从而验证中医药对CIK细胞的增效作用。方法：1临床部分根据纳入标准,纳入60例Child-pugh肝功能评分A级或B级、体力状态(PS)评分0-2分的Ⅲc或Ⅳ期肝细胞癌患者,随机分为治疗组及对照组。治疗组给与健脾理气抑瘤方联合CIK细胞治疗(健脾理气抑瘤方：150mL bid po,d1-30；CIK细胞治疗：(1-3)×10/次qd ivd,d1-3),治疗组给与辨证中药汤剂联合CIK细胞治疗(辨证中药汤剂：150mL bid po,d1-30:CIK细胞治疗:(1-3)×109/次 qd ivd,d1-3),均为30天/周期,治疗2周期或以上。首要终点为疾病进展时间,次要终点为总生存期、疾病控制率及毒性反应。观察治疗前后PS评分、Child-pugh肝功能评分、生活质量、免疫功能以评价两组疗效。2实验部分实验部分分为两部分：①通过MTS法研究健脾理气抑瘤方对Bel-7402细胞增殖的抑制作用,Annexin V/PI双染法及PI单染法探讨其增殖抑制作用的相关机制,通过Western Blot法检测研究其机制作用的蛋白靶点。②通过MTS法研究研究健脾理气抑瘤方联合CIK细胞对Bel-7402细胞增殖的抑制作用,通过CalcuSyn分析软件计算联合指数(Combination Index,CI)和剂量减小指数(Dose-reduction index,DRI)了解两者是否存在协同作用；通过western Blot法了解其协同作用的蛋白靶点。成果：1临床部分1.1临床特征2011年1月至2014年1月在广东省中医院肿瘤科共纳入病例60例,治疗组、对照组各30例。截至2014年5月31日,没有病例中途退出或因失访而脱落,所有病例均已死亡,没有截尾数据。两组治疗前在年龄、性别、ECOG PS评分、门静脉栓塞、TNM分期、HBV病毒感染、Child-Pugh评分、甲胎蛋白、中医辨证分型方面差异均无统计学意义(P>0.05),组间分布均衡。1.2疾病控制率治疗组SD 11例(36.7%),PD 19例(63.3%),疾病控制率为36.7%；对照组SD 9例(30.0%),PD 21例(70.0%),疾病控制率为30.0%。两组DCR对比无统计学意义(P=0.785)。1.3疾病进展时间治疗组的中位TTP为3.7月,优于对照组的2.5月,差异有统计学意义(P=0.006)。1.4总生存期治疗组的中位OS为5.2月,优于对照组的4.6月,差异无统计学意义(P=0.083)。1.5 PS评分、Child-Pugh评分两组治疗结束后PS评分、Child-Pugh评分较治疗前下降,其中治疗组PS评分治疗前后差异有统计学意义(P=0.03),对照组PS评分差异无统计学意义。两组Child-Pugh评分治疗前后均无统计学意义。1.6免疫功能两组治疗前免疫功能对比无统计学意义(P>0.05)。两组的CD3+、CD4+、NK+经治疗后均较治疗前上升,差异具有统计学意义(P<0.05),提示无论是健脾理气抑瘤方或辨证中药,联合CIK细胞治疗均可改善患者免疫功能；治疗组CD8+的治疗后较前上升,差异有统计学意义(P<0.05),对照组治疗前后差异无统计学意义。两组免疫功能评分的CD3+差值对比有统计学意义(P<0.05)。1.7生存质量两组治疗前生存质量评分对比无统计学意义(P>0.05)。两组经治疗后5项功能领域及总健康得分均较治疗前上升,各项症状条目治疗后得分均下降。其中治疗组治疗前后躯体功能、角色功能、情感功能、总健康、疲倦、恶心呕吐、气短、食欲、便秘、腹泻领域差异均有统计学意义(P<0.05),提示治疗组以上功能领域及总健康状况改善,以上症状减轻；对照组治疗前后躯体功能、疲倦差异具有统计学意义(P<0.05)。两组生存质量评分中的总健康和疲倦差值对比有统计学意义(P<0.05)。1.8亚组分析1.8.1两组PS评分相同的患者预后差别治疗组、对照组PS评分0-1分的病例分别有6例、7例,中位TTP分别为7.3月、4.4月,两者存在统计学意义(P=0.02)；中位OS分别为7.3月、5.2月,两者差异无统计学意义(P=0.20)。治疗组、对照组PS评分2分的病例分别有24例、23例,中位TTP分别为3.5月、2.5月,两者差异有统计学意义(P=0.03)；中位OS分别为5.0月、4.6月,两者差异无统计学意义(P=0.15)。1.8.2两组Child-Pugh评分相同的患者预后差别治疗组、对照组Child-pugh评分为A级的病例分别有19例、21例,中位TTP分别为4.6月、2.6月,两者差异有统计学意义(P=0.02)；中位OS分别为6.6月、4.8月,两者无统计学意义(P=0.33)。治疗组、对照组Child-pugh评分B级的病例分别有11例、9例,中位TTP分别为2.8月、2.5月,两者无统计学意义(P=0.06)；中位OS分别为5.0月、4.4月,两者无统计学意义(P=0.20)。1.9不良反应在CIK细胞回输后,治疗组出现2例、对照组出现1例发热,体温最高均≤41℃,血培养检测呈阴性,经对症支持治疗后24h内体温均可降至正常范围。所有病例均未见血液学毒性及肝肾毒性反应,没有因不良反应而终止治疗。2实验部分2.1健脾理气抑瘤方对人肝癌细胞Bei-7402增殖的抑制作用及相关机制的研究2.1.1 MTS法检测健脾理气抑瘤方对Bei-7402细胞增殖的抑制作用健脾理气抑瘤方在不同时间点均对Bel-7402细胞有增殖抑制作用,且在同一时间点上,细胞率随着药物浓度增加而提高。同一剂量下,24h时药物的抑制作用最强,随着时间增加,药物的抑制作用逐渐减弱。2.1.2健脾理气抑瘤方对Bei-7402细胞的周期阻滞作用在不同浓度的健脾理气抑瘤方溶液作用24h后,Bel-7402细胞的GO/G1期比例随着药物浓度的增加而增加,M期比例则随着药物浓度的增加而下降,两者均程剂量依赖关系。其中药物浓度为4mg/mL 和8mg/mL的G0/G1期和M期与Omg/mL相比,均有统计学意义(P<0.05)。2.1.3健脾理气抑瘤方对Bei-7402细胞的诱导凋亡作用在不同浓度的健脾理气抑瘤方溶液作用24h后,各浓度组右下象限Annexin V阳性细胞比例对比对照组未见明显增加,提示Bei-7402细胞无早期凋亡；同时各组左上象限及右上象限比例亦未较对照组明显增加,未见Bei-7402细胞坏死及晚期凋亡。2.1.4健脾理气抑瘤方对Bel-7402细胞信号通路的影响健脾理气抑瘤方溶液8mg/mL作用于Bei-7402细胞1、2、4、8h时,均能下调P-STAT3的表达,上调P-AKT的表达；1、2、4、8、24h时,对P-ERK有上调作用,且随着时间增加而磷酸化作用增强,在24h时P-ERK最为明显；24h时P53表达较0h时明显增加；在8、24h时Bcl-xL表达较0h时明显下调。2.2健脾理气抑瘤方方联合CIK细胞对人肝癌细胞Bei-7402增殖的抑制作用及相关机制的研究2.2.1 MTS法检测健脾理气抑瘤方联合CIK细胞对Bei-7402细胞增殖的抑制作用在同一时间点、相同的中药浓度情况下,Bel-7402细胞的存活率随着效靶细胞比的提高而逐渐下降,呈剂量依赖关系,其中在48h、72h时,E：T=20：1与E：T=0相比均有统计学意义。在同一时间点下,当CIK细胞效靶细胞比(E：T)=5：1时,Bel-7402细胞存活率随着中药浓度的增加而下降,差异有统计学意义；然而当CIK细胞E：T=10：1或E：T=20：1时,随着中药浓度的增加,Bel-7402细胞存活率并未明显下降,差异无统计学意义。在相同的中药浓度情况下,当CIK细胞E：T=20：1时,Bel-7402细胞存活率随着时间的增加而在48h时呈下降趋势,但与24h相比差异无统计学意义；72h与48h的存活率相仿,差异无统计学意义。当CIK细胞E：T=5：1或E：T=10：1时,Bei-7402细胞存活率随着时间的增加而呈先下降后上升的趋势,24h与48h、48h与72h的差值均无统计学意义。联合指数方面,24h时2mg/mL、4mg/mL的中药浓度与各效靶细胞比联合,联合指数均小于0.7。随着中药浓度和作用时间的增加,联合指数逐渐增大。剂量减少指数方面,在相同的时间点及效靶细胞比下,随着中药的浓度增加,CIK的剂量减少指数逐渐增加,增加的趋势在24h、E：T=5：1时最为明显。在相同的时间点及中药浓度下,随着CIK的效靶细胞比增加,JLYF的剂量减少指数逐渐增加,增加的趋势在48h、中药浓度小于等于8mg/mL时最为明显。2.2.2 Western Blot法检测健脾理气抑瘤方联合CIK细胞对人肝癌细胞Bei-7402细胞信号通路的影响当健脾理气抑瘤方与CIK细胞联合作用对Bel-7402细胞联合作用时,P-STAT3表达随时间增加而逐渐上调,强度与CIK细胞单独作用时相仿。当健脾理气抑瘤方与CIK细胞对Bel-7402细胞联合作用1、2、4h时,P-AKT无明显变化;至24h时,P-AKT出现下调,与Oh对比差异有统计学意义。健脾理气抑瘤方与CIK细胞对Bei-7402细胞联合作用1、2、4h时,P-ERK1/2无明显变化；至24h时,P-ERK1/2出现下调,但与Oh对比差异无统计学意义。健脾理气抑瘤方与CIK细胞对Bei-7402细胞联合作用24h时,P53表达较0h时明显增加,且高于健脾理气抑瘤方或CIK细胞单独作用时的表达,与0h对比差异有统计学意义。健脾理气抑瘤方与CIK细胞对Bei-7402细胞联合作用4h、24h时,Bcl-xL表达较0h时明显下调,与0h对比差异有统计学意义。结论：1临床研究1.1中医药联合CIK细胞治疗晚期肝细胞癌,能延长患者的疾病进展时间,改善体力状态评分及免疫功能,提高患者生存质量,其中健脾理气抑瘤方联合CIK细胞治疗的以上作用更为明显。1.2对晚期ECOG PS评分0-2分或Child-Pugh评分A级的肝细胞癌患者,健脾理气抑瘤方联合CIK细胞可能是更优的治疗方案。2实验研究2.1健脾理气抑瘤方对Bel-7402细胞有增殖抑制作用,且抑制作用呈剂量依赖关系。增殖抑制作用可能与健脾理气抑瘤方阻滞Bel-7402细胞于G0/Gl周期有关,可能通过下调P-STAT3、Bcl-xL的表达,上调P-AKT、P53及P-ERK1/2的表达相关,是多蛋白、多信号通路共同介导的作用。2.2健脾理气抑瘤方联合CIK细胞对肝癌Bel-7402细胞有增殖抑制作用,在特定的药物剂量及效靶细胞比的情况下,两者的联合作用可表现为协同杀伤作用。协同杀伤作用的机制可能与两者联合上调P53表达、下调Bcl-xL表达相关。