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化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段,化学药物剂量的增加无疑可以最大程度消除肿瘤患者体内的肿瘤负荷及缓解期体内微小的肿瘤残留灶,有助于提高患者的长期无瘤生存率,但其引起的骨髓抑制是造成患者严重感染、出血、死亡的主要原因。如何提高骨髓造血细胞对化疗的耐受性,一直是人们所关注的焦点。为此,将耐药基因导入骨髓细胞使之获得耐药表型以增加骨髓对化疗药物的耐受性已获得成功,尽管临床广泛应用尚存在某些问题,但应用潜力很大。其中研究最多的是多药耐药基因（mdr1）,它可编码高度糖基化的跨膜蛋白,将药物从细胞内泵出到细胞外,降低细胞内药物浓度,因而减少细胞毒性,将mdr1转染骨髓造血细胞的化疗保护作用在动物实验得到证实,但临床应用尚不理想,同时转染mdr1的小鼠出现了骨髓增殖综合症的报道更令人担忧。近年多种化疗药物的耐药基因被发现,如:对环磷酰胺耐药的醛脱氢酶基因、对烷化剂耐药的六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因、对5-FU耐药的胸腺嘧啶合成酶基因、对氨甲喋呤耐药的二氢叶酸还原酶基因、对阿糖胞苷耐药的胞苷脱氨基酶基因等。并得出如下结论:理想的耐药基因应具备多种药物耐药而非单一药物、无免疫原性、治疗基因片段较小、耐药基因耐特异药不宜毒性过大、基因转染无突变及癌变产生。经实验证实,人突变的二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolate reductase,DHFR）与胞苷脱氨基酶基因（cytidine deaminase,CD）具备上述条件。为解决大剂量化疗所引起的骨髓抑制问题,我们将DHFR与DHFR-CD基因通过包装细胞PA317导入小鼠骨髓细胞后,将转染DHFR-CD基因的小鼠骨髓细胞移植给小鼠,观察大剂量化疗后的小鼠的血象、体重、生存率变化及小鼠骨髓细胞耐药CFU-GM集落生成情况;同时检测小鼠骨髓细胞耐药基因的表达情况。进而评估转染了DHFR-CD基因的小鼠骨髓细胞对大剂量化疗的耐受性,以了解所转染基因在小鼠体内的化疗保护作用,为以后的双耐药基因临床应用提供动物实验模型。方法一、质粒扩增感受态细胞置于离心管中,分别加含质粒DHFR、DHFR-CD及普通培养基,摇振后铺于含抗生素的琼脂平板表面,液体被吸收后倒置培养,其菌落接种于培养液后培养过夜收集菌沉淀,质粒提取、纯化按试剂说明书进行。二、细胞的培养双噬性包装细胞PA317及小鼠成纤维细胞NIH3T3均于10%小牛血清的DMEM培养基中,37℃、5%CO2的饱和湿度条件下维持细胞生长,PA317供转染;NIH3T3细胞用作病毒上清滴度测定及辅助病毒的检测。三、细胞转染、克隆筛选及扩增采用脂质体LipofectamineTM2000介导的转染技术将质粒DHFR及DHFR-CD分别转染PA317细胞株后,用不同浓度的氨甲喋呤和阿糖胞苷进行药物筛选获得耐药克隆并扩增耐药细胞数量,另设不加质粒的对照转染组。四、小鼠骨髓细胞的制备Balb/c小鼠尾静脉注射5-Fu,3天后脱颈处死,酒精浸泡,取其股骨和胫骨,收集骨髓细胞制成悬液,淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,悬于20%FCSRPMI1640的塑料培养瓶中,37℃、5%CO2孵箱中培养2h,回收悬浮的骨髓单个核细胞。五、小鼠骨髓细胞的感染计数小鼠骨髓单个核细胞总数,使骨髓单个核细胞和转基因之病毒产生细胞按1:1的比例,置于含20%小牛血清和1%谷氨酰胺的10%WEHI条件培养液中,另设对照组用不加质粒转染组的PA317细胞。两组在37℃、5%CO2条件下共培养48h后收集骨髓细胞,制成细胞悬液,置PBS平衡液中作CFU-GM培养及小鼠体内移植用。六、感染DHFR和DHFR-CD后的小鼠骨髓细胞CFU-GM及耐药基因的检测检测共培养后经药物处理的小鼠骨髓细胞的CFU-GM生成及前病毒基因整合及表达情况,培养分为两组:实验组加入化疗药;对照组不加化疗药,培养第12d后计数集落,进行结果分析。PCR检测转染DHFR小鼠骨髓细胞前病毒基因整合（proviral integration）;RT-PCR检测转染DHFR-CD小鼠骨髓细胞基因表达,提取其RNA、逆转录成cDNA、PCR扩增及电泳PCR产物。七、感染DHFR-CD后的小鼠骨髓细胞的小鼠体内实验Balb/c小鼠在致死量钴60照射后根据体重随机分为两组:实验组尾静脉注射感染后的小鼠骨髓细胞,对照组注射同等数量转染对照组的小鼠骨髓细胞,细胞移植后4周,每只小鼠腹腔注射MTX和Ara-C,连续4d。观察小鼠血象、体重及生存率的变化;5周后两组各处死小鼠1只,取其骨髓细胞做CFU-GM培养及耐药基因检测。结果一、稳定的产病毒细胞扩增、纯化的质粒转染PA317细胞、经药物筛选后见耐药克隆生长,扩大培养其耐药基因检测阳性;以NIH3T3为靶细胞测定逆转录病毒滴度,当病毒原液为0.01 ml时,DHFR和DHFR-CD病毒滴度分别为3.21×104CFU/mL、3.35×104CFU/mL;病毒原液为0.10ml时,DHFR和DHFR-CD病毒滴度分别为1.43×105CFU/L、1.54×105CFU/L;辅助病毒的检测无复制活性病毒产生。表明制备的逆转录病毒或转染的PA317可供感染细胞用。二、转染DHFR小鼠骨髓细胞的体外实验1、小鼠骨髓细胞耐药克隆形成实验:实验组、对照组均不加MTX时其耐药克隆数分别为287和273,加入时其耐药克隆数分别为42（14.6%）和0,两组克隆出现率比较具有显著性差异（P＜0.05）,说明转染DHFR的小鼠骨髓细胞对MTX有明显的耐受性。2、实验组PCR产物电泳显示转染基因条带而对照组未显示,说明小鼠骨髓细胞已成功转染DHFR基因。三、转染DHFR-CD小鼠骨髓细胞的体外实验1、小鼠骨髓细胞耐药克隆形成实验:实验组、对照组均不加入MTX和Ara-C,其耐药克隆数分别为307和296,加入两药其耐药克隆数分别为47（15.3%）和0,两组克隆出现率比较具有显著性差异（P＜0.05）,说明转染双耐药基因的小鼠骨髓细胞对MTX和Ara-C有明显的耐受性。2、实验组RT-PCR产物电泳显示转染基因条带而对照组未显示,说明转染的DHFR-CD在分子生物学上有表达。四、转染DHFR-CD小鼠骨髓细胞的体内实验1、转双耐药基因小鼠在大剂量MTX和Ara-C注射后,小鼠体重、白细胞开始下降,但较对照组下降幅度小,至第6周其白细胞恢复正常;其存活率为66.7%而对照组为0,两组比较具有显著性差异（P＜0.0 1）。2、小鼠骨髓细胞耐药克隆形成实验:实验组、对照组不加入MTX和Ara-C,两组耐药克隆数分别为167和173,两组加入两药其耐药克隆数分别为42（25.1%）和0,两组比较具有显著性差异（P＜0.05）,说明转基因小鼠对两种药物有一定程度的抗药性。3、转基因组小鼠骨髓细胞经RT-PCR检测,显示有耐药基因条带而对照组未显示,说明经转染的耐药基因在小鼠体内有表达。结论1、采用脂质体转染技术将质粒DHFR及DHFR-CD转染入PA317细胞株,可以获得安全稳定的产病毒的细胞系。2、小鼠骨髓细胞与产病毒的细胞共培养可以将耐药基因转染到小鼠骨髓细胞,且能够有效的表达并显示出良好的抗药性。3、转基因小鼠,其骨髓中可检测到被转染的耐药基因且小鼠生存率提高,说明了该基因在小鼠体内起到了对小鼠的化疗保护作用。