FK506结合蛋白51（FKBP51）是一种51k Da免疫亲和蛋白,属于FK506结合蛋白家族（FKBPs）,以其具有可与免疫抑制因子FK506结合的能力而命名,也称FKBP5。FKBP5由三个结构域组成,包括FKBP型肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIase）结构域（称为FK1）、FKBP样结构域（FK2）、三个肽重复结构域（TPR）。由于其分子结构,FKBP5是多种蛋白质的分子伴侣。迄今为止,FKBP5的主要共伴侣分子包括应激相关蛋白（Hsp90）、类固醇激素受体（GR、AR、PR）、细胞信号蛋白（Akt、IKKα、IKKε、MAPK）以及细胞骨架蛋白（TRAF2、Tau）等。FKBP5在应激性内分泌和糖皮质激素信号传导中起着重要作用。应激和糖皮质激素可强烈诱导FKBP5的表达,人类一些FKBP5单核苷酸多态性等位基因（如rs1360780,rs9470080,rs9296158,rs3800373等）可上调FKBP5对皮质醇诱导反应性,也伴随着更高的应激相关疾病风险。近年来越来越多的临床研究证明,FKBP5基因型与各种精神疾病（如抑郁症、创伤后应激障碍、焦虑症等）的应激源之间存在相互作用。流行病学研究还发现,与应激相关的精神疾病中骨质疏松症的共同患病率显著增加,骨质疏松症是目前最常见的代谢性骨病,对公共健康造成严重影响,严重骨质疏松症是一种高死亡率和高发病率的疾病。骨缺损是一种严重的骨科疾病,其治疗具有挑战性。超临界大面积或大段骨缺损仍是目前临床面临的难题。研究者们致力于研发人工骨材料,但为了解决人工骨材料成骨效应不良的问题,人们越来越关注间充质干细胞在骨组织工程中的应用。间充质干细胞（MSC）起源于中胚层细胞,具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞等多种间质细胞亚群的功能。间充质干细胞最早在骨髓中发现,现研究者发现也可从胎盘、脐带、脂肪等组织分离出MSC。MSC可作为种子细胞应用于骨组织修复,为骨质缺损、骨组织损伤修复带来新的治疗策略。临床吸脂手术每次可产生100～3000毫升的脂肪组织,手术创伤小且获得脂肪组织数量较大,该材料在术后通常被作为医疗废物丢弃。脂肪组织中可分离培养出人脂肪干细胞（hASCs）,即为脂肪组织来源的间充质干细胞,同样具有自我增殖和多向分化能力,使其成为修复组织损伤理想的种子细胞。但是目前,脂肪干细胞用于骨缺损仍然存在许多局限和挑战。比如:在缺血组织中,成骨分化效率低等问题。那么如何提高诱导效率,使其更加稳定、可控性骨分化以增加治疗成功率,是临床治疗亟需解决的问题。FKBP5在众多组织中表达,包括脑、骨髓、脂肪组织等,其表达水平和调节模式在不同组织间存在差异（http://biogps.org/）。MSC位于中胚层,具有成骨潜能,在骨发育和骨代谢中起重要作用。然而,FKBP5是否参与MSC成骨过程,目前尚不明确。为此,本研究选择FKBP5作为靶分子,以hASCs为研究对象,旨在探讨FKBP5在hASCs成骨中的作用及其机制。我们的研究结果发现,应用SAFit2,一种通过诱导配合机制选择性抑制FKBP5功能的抑制剂,可以使hASCs高效、快速地向成骨细胞分化;进一步实验结果还发现SAFit2对hASCs成骨分化的影响部分是通过糖皮质激素受体（GR）途径介导的。我们的研究结果可能为临床骨质疏松症患者的骨代谢平衡提供新的策略,并提高干细胞移植治疗骨缺损的效率。第一部分hASCs的分离提取、培养及鉴定目的:体外从正常成人临床抽脂术后废弃脂肪组织中分离提取、扩增培养hASCs,并进行鉴定,为后续实验奠定基础。方法:正常成人吸脂后的脂肪组织经过消化、贴壁培养、扩增、纯化等,得到hASCs,观察细胞形态。收集P3代hASCs,采用流式细胞术鉴定hASCs表面特征性标志物的表达。结果:成功从脂肪组织中提取hASCs,镜下观察细胞呈现漩涡状、贴壁式生长,形态呈长梭形,流式细胞检测结果显示:CD34、HLA-DR的低表达,CD73、CD90、CD44的高表达,符合间充质干细胞的表达标志特征。结论:本部分实验成功的提取了hASCs,为后续实验提供可靠稳定的细胞来源。第二部分FKBP5对hASCs成骨诱导分化的影响目的:观察hASCs在诱导成骨分化过程中FKBP5的动态变化,并明确其对hASCs成骨分化的影响。方法:（1）选择P3代hASCs,加入常规成骨诱导液（地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸）,分别在0-72h不同时间点收取细胞,采用实时定量-聚合酶链反应（RTq PCR）、蛋白免疫印迹（Western Blot）技术检测成骨过程中FKBP5基因及蛋白表达水平;（2）对P3代hASCs进行成骨诱导分化,选用小分子化合物SAFit2（500n M）特异性抑制FKBP5的功能。实验设置为4组:（1）hASCs培养基对照组（PM组）;（2）hASCs培养基+SAFit2组（PM+S组）;（3）成骨诱导液组（OM组）;（4）成骨诱导液+SAFit2组（OM+S组）。采用茜素红染色在细胞化学水平上检测hASCs成骨分化后细胞外钙的差异;采用RT-qPCR、Western Blot技术检测hASCs诱导分化过程中成骨相关基因及蛋白的表达差异,并观察FKBP5对hASCs成骨诱导分化是否有影响。结果:（1）hASCs成骨诱导分化早期（诱导后2-72h）,FKBP5基因和蛋白表达均显著上调。（2）SAFit2可促进hASCs成骨分化;（3）SAFit2使早期成骨相关基因碱性磷酸酶表达增加;（4）SAFit2使晚期成骨相关基因骨桥蛋白表达增加;（5）SAFit2使早期成骨相关蛋白RUNX2表达增加。结论:hASCs成骨分化早期,FKBP5基因和蛋白表达升高,这提示在成骨分化早期,FKBP5基因上调可能对hASCs骨分化产生一定影响。使用常规成骨诱导液,可使hASCs成功诱导分化为骨细胞,加入FKBP5特异性抑制剂SAFit2能够促进hASCs成骨分化,并在细胞化学水平、mRNA水平以及蛋白水平均证实了FKBP5对hASCs成骨诱导分化有一定的抑制作用。第三部分FKBP5抑制hASCs成骨分化的作用机制目的:探讨FKBP5抑制hASCs成骨分化的可能作用机制。方法:分别在hASCs诱导成骨后不同时间点收取细胞,采用RT-qPCR、Western Blot等方法分别检测成骨诱导分化早期,糖皮质激素受体基因（NR3C1）及蛋白（GR）表达水平;采用免疫共沉淀（Co-IP）方法检测在成骨诱导体系中GR是否为FKBP5的共伴侣蛋白;采用不同剂量地塞米松（Dex 0.1μM,1μM）分别作用于OM组以及OM+S组,观察SAFit2促进hASCs成骨分化作用是否存在Dex剂量依赖性。结果:（1）hASCs成骨分化早期GR表达降低,与FKBP5升高成反比关系;（2）hASCs成骨过程中GR是FKBP5的分子伴侣;（3）SAFit2促进hASCs成骨分化具有Dex剂量依赖性。结论:FKBP5影响hASCs成骨诱导分化的作用部分是通过GR途径介导的。全文研究结论:1、本实验成功从人脂肪组织中提取了hASCs;2、hASCs经诱导可成功分化为骨细胞;hASCs成骨诱导分化早期,FKBP5基因表达上调;加入FKBP5抑制剂SAFit2可以使hASCs高效、快速的向成骨细胞分化。3、FKBP5影响hASCs成骨诱导分化的作用部分是通过GR途径介导的。