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目的:1)在食管癌Eca109和KYSE150细胞中改变表观遗传学修饰并检测该修饰对食管癌细胞形态、细胞周期和细胞凋亡变化的影响,为今后临床食管癌使用TSA和5-Aza-dC的药物治疗奠定前期实验基础;2)以PTEN、Survivin和IKKα/IKKβ为抑癌基因、癌基因和肿瘤转移基因(癌基因)的代表,观察TSA和5-Aza-dC对靶基因甲基化和细胞内乙酰化的作用;深入观察低甲基化联合高乙酰化的结果。探讨食管癌发生中癌基因、抑癌基因和肿瘤转移基因(癌基因)的甲基化和乙酰化修饰的可逆性、不一致性和甲基化联合乙酰化的交互作用结果;3)将靶基因表观遗传学修饰改变、表达异常和食管癌发生相关联,探究在食管癌中改变表观遗传学修饰对癌基因、抑癌基因和肿瘤转移基因(癌基因)表达的影响,为临床食管癌的早期发现和诊治提供分子检测指标。方法:1)以人食管鳞状上皮细胞癌Eca109和KYSE150为实验模型,设置药物TSA和5-Aza-dC的梯度作用浓度和时间(TSA为0.08μMol/L、0.4μMol/L、2μMol/L、10μMol/L和50μMol/L;5-Aza-dC为0.2μMol/L、1μMol/L、5μMol/L、25μMol/L和125μMol/L,作用时间为12h、24h和48h),采用CCK-8试剂盒检测,绘制生长曲线并使用公式计算其抑制率,选择药物最佳作用浓度及时间;设立正常对照组、TSA组、5-Aza-dC组和联合用药组,运用细胞形态学观察、细胞周期和细胞凋亡检测指标验证TSA和5-Aza-dC对食管癌细胞是否产生了药物作用,分析比较在不同实验分组中各个指标的变化特点;2)根据课题组前期研究结果[130-131,187](即食管癌中筛选差异表达基因),选择PTEN、Survivin、IKKα和IKKβ作为靶基因,从表观遗传学角度进行检测:①甲基化检测,找到目标基因启动子上游2000bp左右的碱基序列,使用http://cpgislands.usc.edu/和http://www.urogene.org/cgi-bin/Methrimer/Methprimer.cgi软件观察碱基序列中CG分布及甲基化位点的预测情况。根据预测结果从中选择富含CG岛的碱基区段作为受试对象设计甲基化引物;提取实验各组样本的基因组DNA并行BSP法处理;以BSP法处理过的DNA为模板进行PCR扩增并TA克隆测序,用软件将测序结果与原序列对比得出甲基化分布黑白散点图,计算甲基化频率,分析比较变化特点;②乙酰化检测,抽提样本细胞核内的hdac,根据hdac活性检测试剂盒操作提示,建立标准品曲线,使用酶标仪获得吸光光度数值,代入公式计算hdac的相对含量,各组进行统计分析并比较变化特点;3)转录和翻译水检测:real-timepcr技术检测各实验组中靶基因的mrna表达情况;westernblot检测各实验组中靶基因的蛋白表达情况;结合第二部分实验结果,将上述指标进行相关性分析,验证甲基化、乙酰化和甲基化+乙酰化作用对靶基因在食管癌中表达的影响及可能存在的相互调控关系。结果:1)细胞学各项结果显示:①tsa和5-aza-dc在48h对eca109细胞的有效药物作用浓度为2μmol/l和5μmol/l。eca109细胞对两类药物表现出随药物强度增加和作用时间延长出现的生长抑制,其中tsa作用更显著(p<0.05);②超微结构改变常常会早于细胞大体形态改变,且联合用药比单独用tsa或5-aza-dc产生破坏细胞超微结构作用更明显;③单独用药和联合用药都可以促进细胞凋亡,其中tsa和联合用药促进细胞凋亡作用显著(p<0.05);kyse150细胞对不同分组药物的敏感性弱于eca109细胞。④单独用药和联合用药可以使两类细胞被阻滞于细胞周期的不同时限内。tsa可阻滞eca109细胞于g0/g1期和g2/m期、阻滞kyse150细胞于g2/m期;5-aza-dc阻滞两类细胞于s期;联合用药组阻滞两类细胞于g2/m期。2)甲基化和乙酰化检测:①抑癌基因pten启动子区域甲基化频率较高,使用5-aza-dc后甲基化频率降低(p<0.01),联合tsa用药后甲基化频率降低明显(p<0.01);癌基因survivin启动子区域甲基化频率较低,使用药物干预后甲基化频率降低不明显;肿瘤转移基因(癌基因)ikkα和ikkβ启动子区域甲基化频率较survivin高,但低于pten;使用5-aza-dc后甲基化频率降低(p<0.05),联合tsa用药后甲基化频率降低明显(p<0.01)。②不同食管癌中hdac浓度含量不一致,tsa作用后可有效降低细胞核内hdac含量,联合5-aza-dc并没有出现显著降低hdac的作用。3)靶基因表达:①抑癌基因pten:mrna和蛋白在不同类型食管癌中的表达较为一致;tsa或5-aza-dc均有助于食管癌中pten表达升高,两药联合作用后表达则显著增高(p<0.01);相关性分析显示其甲基化改变与mrna负相关(p<0.01),与蛋白表达呈负相关趋势(无统计学意义);乙酰化改变与mrna有负相关趋势(无统计学意义),与蛋白表达呈负相关(p<0.05)。②癌基因survivin:mrna在不同类型食管癌中的表达较为一致,蛋白表达在eca109中高于kyse150(p<0.05);tsa和5-aza-dc分别可以抑制食管癌中survivin的高表达,两药联合作用后表达进一步被抑制,相关性分析显示甲基化和乙酰化改变与survivin表达呈正相关趋势,相关性较低。③肿瘤转移基因(癌基因)ikkα/ikkβ:mrna在不同类食管癌中的表达较为一致,ikkα蛋白表达在kyse150中较高,ikkβ蛋白表达在eca109中较高;tsa和5-aza-dc分别可以抑制食管癌中ikkα/ikkβ的高表达,两药联合作用后表达进一步被抑制(p<0.01),相关性分析显示乙酰化改变与IKKα表达呈负相关(P<0.05),相关性较高,甲基化频率与其有正相关趋势,但相关系数较低;甲基化频率和HDAC浓度的改变与IKKβ有正相关趋势,但是相关性较低。结论:1)TSA和5-Aza-d C在抑制食管癌细胞生长方面存在差异,单独用药和联合用药对食管癌细胞生长影响不同,说明TSA主导的增高乙酰化和5-Aza-dC主导的降低甲基化及二者联合作用对食管癌细胞的生长有阻碍作用,这为今后用表观遗传学理论指导临床用药提供治疗参考;2)以PTEN、Survivin和IKKα/IKKβ为代表的抑癌基因、癌基因和肿瘤转移基因(癌基因)在食管鳞状细胞癌中的甲基化修饰程度不同,本研究显示抑癌基因PTEN>肿瘤转移基因(癌基因)IKKα/IKKβ>癌基因Survivin;在上述三类基因中,5-Aza-dC可有效的产生去甲基化作用,但TSA不能够显著改变启动子区域甲基化状态,联合用药时TSA有助于5-Aza-dC去甲基化作用增强;3)不同类型食管癌细胞中,乙酰化修饰程度不一致体现在HDAC的浓度上。TSA可以有效地降低细胞内HDAC含量,联合去甲基化作用后并不增强TSA产生的提高乙酰化作用;4)改变表观遗传学对食管鳞状上皮细胞癌修饰结果导致靶基因在mRNA和蛋白水平有不同程度的表达升高或抑制,具体是抑癌基因PTEN甲基化降低、乙酰化升高促进该基因表达;癌基因Survivin经药物作用后表观遗传学修饰改变不明显,但最终该基因表达有改变,可能是受到PTEN和IKKα/IKKβ局部调控作用;IKKα甲基化降低、乙酰化升高抑制该基因的表达;IKKβ甲基化降低,乙酰化升高抑制该基因表达。以甲基化和乙酰化为主的表观遗传学修饰改变可能更多的参与了PTEN和IKKα/IKKβ的表达调控,而直接未参与调节Survivin的表达。