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背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性炎症性、自身免疫疾病,给患者造成了不可忽视的健康和经济负担,其主要发病机制为滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)的增殖和浸润。在类风湿关节炎治疗中一个关键策略是诱导类风湿关节炎中滑膜成纤维细胞(RA-FLS)的凋亡,并且有文献报道丹参酮-IIA(Tanshinone IIA,Tan IIA)可以抑制RA-FLS的增殖,并促进其凋亡,从而阻碍RA进展,但具体机制尚不是很清楚。目的:探讨Tan IIA对RA-FLS的促凋亡作用以及可能机制。方法:1.首先,提取研究对象滑膜组织中的滑膜成纤维细胞:纳入2016.10-2018.10苏北人民医院住院且将进行关节置换或滑膜切除术的RA患者16例,创伤性膝关节患者7例作为对照。在术中获得所有研究者滑膜组织样本,通过胰蛋白酶等消化分解滑膜组织,然后提取并分离FLS,分为类风湿关节炎FLS组(RA-FLS)以及健康FLS组(NC-FLS)。并将FLS进行传代培养用于下一步实验。2.Tan IIA处理RA-FLS:不同剂量的Tan IIA加入至RA-FLS细胞悬浮液进行处理,分别在不同时间段、不同浓度进行观察。3.分析经Tan IIA处理后的RA-FLS活性以及凋亡率。3.1用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)测定经过Tan IIA处理后的RA-FLS(RA-FLS+Tan IIA)活性,并与未使用Tan IIA进行处理的RA-FLS(RA-FLS-Tan IIA)进行对比。3.2用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒以及流式细胞荧光分选技术(FACS)等方法进行分析以及计算RA-FLS+Tan IIA凋亡率,并与RA-FLS-Tan IIA进行对比。4.研究Tan IIA作用于RA-FLS的可能位点。4.1使用Real-time PCR进行测定RA-FLS、NC-FLS以及RA-FLS+Tan IIA中长链非编码RNA GAS5(lnc RNA GAS5)含量,并进行对比。4.2将Tan IIA处理的RA-FLS细胞通过si RNA-GAS5转染,进行lnc RNA GAS5敲低,并使用CCK-8试剂盒测定其RA-FLS活性。5.使用免疫印迹法(Western blot)测定RA-FLS中半胱天冬酶-3(caspase-3)、半胱天冬酶-9(caspase-9)、Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-AKT和p-m TOR等蛋白表达并进行对比,明确Tan IIA促RA-FLS凋亡的信号通路。6.统计学处理:使用SAS 6.12软件包进行所有统计学分析。实验数据以均数±标准差表示,t检验(Student’s t test)用于分析两组之间的差异,单因素方差分析(One-way ANOVA)用于组间均数比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.RA-FLS经Tan IIA处理后,其活性降低并且细胞凋亡率增加。2.在RA-FLS中,lnc RNA GAS5表达显着降低,而经Tan IIA处理后导致lnc RNA GAS5的表达上调。同样的,使用si RNA敲低lnc RNA GAS5后可以抑制RA-FLS凋亡。3.Lnc RNA GAS5的敲低激活磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号传导途径,并抑制RA-FLS细胞中裂解的半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)和裂解的半胱天冬酶-9(cleaved caspase-9)的表达。结论:1.Tan IIA可促进RA-FLS的凋亡,其中lnc RNA GAS5是重要的作用位点。2.Tan IIA可通过抑制PI3K/AKT信号通路以及上调cleaved caspase-3、cleavedcaspase-9的表达以促进RA-FLS的凋亡。