随着人类社会的飞速发展,人类某些中枢神经退行性病变[如帕金森病（Parkinson’s disease, PD）,阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）等]和中枢神经系统（central nerve system, CNS）损伤[如脑外伤（Traumatic Brain Injury, TBI）,脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）)]的发病率也不断增加。由于目前临床所采用的药物或手术治疗还无法从根本上治疗这些疾病,因此尚需要探索新的途径。干细胞再生医学的应运而生,特别是细胞、组织、器官的移植替代治疗为修复CNS退行性或损伤性疾病提供了新的希望。哺乳动物体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT）技术和人类胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）技术的重大突破,提出了治疗性克隆（Therapeutic Clone, TC）的概念。通过SCNT技术来获取个体的专有ESCs,并使ESCs分化为治疗所需要的细胞、用以替代或修复衰老或创伤坏死的细胞,从而达到治疗疾病的目的。然而,SCNT的效率低下限制了TC的发展。因此,探索如何提高SCNT囊胚形成率成为TC应用的关键前提之一,也成为干细胞治疗应用研究领域关注的热点,主要涉及到供体细胞类型及分化状态、卵母细胞周期、化学处理、核移植方法的改进等诸多方面。目的从提高SCNT效率的角度出发,重点探讨不同直径的去注核针和注核顺序对构建克隆胚的影响以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对克隆胚早期体外发育能力的影响。方法实验首先比较三种不同直径（5～6μm.7～8μm.9～10μm）去核针和注核针的去核和注核效果,筛选合适的去注核针；然后分别采用两步法和一步法进行构建克隆胚,比较两种方法对构建克隆胚及其体外发育的效果；最后通过使用不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚,观察化学处理因素对克隆胚体外发育的影响。1、用三种不同直径的去核针和注核针进行去核和注核获取有活性卵母细胞后、随机将其分为三组,分别用直径为5～6μm、.7～8μm、9～10gm的去核针进行去核操作。通过观察去核后卵母细胞的存活情况,比较三组的去核效果；在注核试验中,获取有活性的卵母细胞,根据去核实验的结果选出合适的去核针,进行统一的去核操作;然后将去核后的卵母细胞随机分为三组,以卵丘细胞为供体,分别使用5～6μm、7-8μm和9-10μm的注核针进行注核操作,通过观察克隆胚复原后的存活率判断注核的效果。2、用两种不同核移植方法构建克隆胚利用显微操作系统,分别采用“先去核、复原30min后再注核”的两步法和“先注核再立即去核”的一步法构建克隆胚。记录两种方法构建克隆胚的时间,以完成单个克隆胚所需的时间来评判两者的效率,并观察两种方法构建克隆胚的存活情况以判断其成功率。氯化锶激活克隆胚后,观察两种方法所构建的克隆胚的激活率、2-cell分裂率和囊胚形成率,比较两方法之间的差异、判断两种方法对克隆胚体外发育的影响。3、添加不同浓度Scriptaid的激活剂处理克隆胚克隆胚构建成功后随机将其分为5组,分别用添加有0nM、50nM、100nM、250nM和500nM Scriptaid的无钙CZB激活剂进行激活6h,然后再用含有相应浓度Scriptaid的KSOM培养基处理4h,最后将克隆胚按组在KSOM液滴中进行体外培养至囊胚。观察各组的激活率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞计数。比较不同浓度的Scriptaid对克隆胚体外发育的影响。4、统计学处理所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。第一部分三组之间总体效果采用x2检验,取检验水准为α=0.05,组间多重比较检验水准为a=0.0125。第二部分组间样本率采用x2检验,取检验水准为a=0.05,两种方法所用时间采用均数±标准差（X±SD）表示,采用两样本t检验,检验水准为a=0.05；第三部分各组样本率之间总体比较采用采用x2检验,取检验水准为a=0.05,各组样本率组间比较检验水准为a=0.0045；囊胚细胞计数采用均数±标准差（X+SD）表示,采用one-way方差分析,检验水准取α=0.05,组间多重比较采用LSD法。结果1、以不同直径去核针、注核针去、注核后的卵母细胞及克隆胚存活率比较1.1去核实验中,5～6μm组、7～8μm组和9～10μm组随机分得卵母细胞数分别为124个、130个和115个。去核后,卵母细胞存活率分别为64.5%（80/124）、92.3%（120/130）和89.6%（103/115）；三种直径去核钊去核后卵母细胞存活率之间的差异有统计学意义（x2=39.691,P<0.001）；5～6μm组与7～8μm组去核后卵母细胞成活率之间差异有统计学意义（x2=29.282,P<0.001）；5～6μm组与9～10μm组相比,去核后卵母细胞成活率之间差异亦有统计学意义（xz=20.867,P<0.001）；7-81μm组与9-10μm组相比,去核后卵母细胞成活率之间无显著差异（x2=0.562,P=0.454）。结果提示：直径7-8μm与9-10μm的去核针去核成功率较好,卵母细胞存活率高,优于直径为5～6μm的去核针。1.25～6μm组、7～8μm组和9～10μm组获得去核的卵母细胞分别为107个、110个和115个,经过注核操作以后,存活的克隆胚分别为89个、96个和71个,存活率分别为83.2%（89/107）、87.3%（96/110）和61.7%（71/115）；三种不同直径的注核针注核后,克隆胚存活率总体之间差异有统计学意义（x2=24.061,P<0.001）；5～6μm组与7～8μm组注核效果之间差异无统计学意义（x2=0.724,P=0.395）；5～6μm组与9～10μm组注核效果之间差异有统计学意义（x2=12.656,P<0.001）；7～8μm组与9～10μm组注核效果之间差异有统计学意义（x2=19.158,P<0.001）；结果提示：直径为5-6μm与7-8μm组的注核针注核成功率均好于9～10μm组。2.两种核移植方法之间的比较两步法和一步法构建克隆胚的成功率分别为77.2%（61/79）和85.1%（63/74）,两组之间差异无统计学意义（x2=1.560,P=0.212）；两步法完成单个克隆胚的时间,平均需要131.57±10.88s；一步法完成单个克隆胚的平均时间则为74.53±11.77s,两组之间差异有统计学意义（t=31.148,P<0.001）；提示一步法完成单个克隆胚所需时间较少,速度相对较快。两种方法所构建的克隆胚的激活率（65.6%VS85.7%,x2=6.855,P=0.009）和2-cell卵裂率（55.0%VS75.9%,x2=4.552,P=0.033）之间差异有统计学意义,一步法均优于两步法,但以两种方法所获克隆胚的囊胚形成率（9.1%VS12.2%；x2=0.145,P=0,704）差异不显著。提示两种核移植方法对克隆胚的囊胚形成率影响不大。3. Scriptaid处理克隆胚后对克隆胚早期体外发育能力的影响各组克隆胚在含有不同浓度的Scriptaid的激活剂激活6h及含相应浓度Scriptaid的KSOM培养基液滴内处理4h后,各组克隆胚的激活率之间差异无统计学意义（x2=0.574,P=0.966）；各组克隆胚的2-cell分裂率之间的差异不显著（x2=1.344,P=0.854）。各组囊胚形成率总体之间的差异则有统计学意义（x2=15.921,P=0.003）；以250nM组的囊胚形成率（24.2%）最好,大约是未处理组（OnM组,5.3%）的4.6倍。OnM组囊胚细胞计数最少（44.67±1.53）,250nM组囊胚细胞计数最多（56.27±2.43）,250nM组的囊胚细胞计数与其他各组的囊胚细胞计数之间均有显著差异,经过250nMScriptaid处理的囊胚质量最好。结论去注核针的直径大小对成功构建克隆胚有重大影响,应根据受体供体细胞的大小选用合适的去注核针。“先去核、复原30min后再注核”的两步法和“先注核后再立即去核”的一步法在构建克隆胚效率上有显著差异,但在克隆胚囊胚形成率上无显著差异。组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid能够提高近交系小鼠克隆胚早期体外发育的囊胚形成率和囊胚质量。其中以250nM的Scriptaid提高近交系小鼠C57/BL6克隆胚早期体外发育能力最强。