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【目的】
1.探索雌激素(E2)对HER2+/ER-/PR-的乳腺癌细胞系SKBR3相关生物学特性的影响。
2.研究ERα36对HER2表达及其信号通路和相关生物学特性的影响。
3.研究ERα36是否通过激活HER2信号通路影响Herceptin的敏感性。
【方法】
1.使用无酚红培养基培养SKBR-3乳腺癌细胞株，同时使用不同浓度的雌激素处理对其进行处理，从而探索雌激素受体阴性的SKBR3细胞对不同雌激素浓度的反应。
2.细胞划痕实验以及CCK8测定不同浓度的雌激素对SKBR3细胞增殖迁移等能力的影响。
3.WesternBlot检不同浓度雌激素处理以后SKBR3细胞ERα36、ERα66、p-HER2、HER2、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK等相关蛋白的表达情况。
4.构建三组不同序列ERα36敲减慢病毒，转染SKBR-3细胞，嘌呤霉素筛选出稳定低表达ERα36的SKBR-3细胞株。
5.采用RT-QPCR检测不同序列ERα36的下调效率。
6.采用AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡，CCK8、Transwell等检测细胞迁移侵袭能力。
7.采用细胞爬片HE染色、细胞免疫化学等检测ERα36下调细胞的生物学特性。
8.WesternBlot检测稳定低表达ERα36的SKBR-3细胞株ERα36、ERα66、p-HER2、HER2、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK等相关蛋白的表达情况。
9.使用CCK8检测稳定低表达ERα36的SKBR-3细胞株对Herceptin的敏感性。
【结果】
1．使用不同浓度雌激素(E2)作用于在雌激素受体阴性的乳腺癌细SKBR3细胞中，通过分析划痕实验、CCK8、WesternBlot等实验检测结果，有以下发现：
(1)低浓度(1nM)雌激素促进肿瘤细胞增殖迁移，低浓度雌激素可有模拟生理浓度的作用，划痕实验以及细胞增殖实验均提示促进乳腺癌细胞增殖迁移。
(2)高浓度(5uM)抑制其生长，划痕实验以及细胞增殖实验均提示抑制乳腺癌细胞增殖迁移。
(3)WesternBlot实验结果显示，低浓度雌激素处理组ERα36、p-ERK、p-AKT等指标表达含量增高，而ERK、AKT总表达量无明显改变。
2.HER2阳性乳腺癌细胞系中，下调ERα36可以抑制乳腺癌细胞增殖、转移、分的能力。
(1)下调ERα36的乳腺癌细胞株sh-RNAERα36-SKBR3与野生型SKBR3细胞相比较，应用CCK8技术测得其增殖能力明显下降，培养过程中可以明显观察到其增长速率慢，Transwell可明显观察到迁移能力下降。
(2)应用AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡，发现sh-RNAERα36-SKBR3与野生型SKBR3细胞相比较凋亡率明显增加。
(3)WesternBlot检测ERα36下调乳腺癌细胞株sh-RNAERα36-SKBR3与野生型SKBR3细胞相比较P-HER2、P-AKT、P-ERK等磷酸化指标表达含量明显降低，然而HER2、AKT、ERK表达总量无明显变化。
3.使用HER2靶向治疗药物Herceptin处理野生型SKBR3以及下调ERα36的乳腺癌细胞株sh-RNAERα36-SKBR3。
(1)下调ERα36以后其对靶向治疗药物Herceptin的敏感性增加，CCK8增殖实验可观察到下调ERα36较野生型SKBR3实验组增殖情况下降。
(2)说明下调ERα36使其对HER2靶向治疗药物Herceptin敏感性较高。
【结论】
在雌激素受体阴性且HER2阳性的乳腺癌细胞(SKBR3)中，发现低浓度的雌激素可促进其增殖迁移，而高浓度的雌激素则会抑制这一过程。并且在WB检测中发现低浓度雌激素处理的实验组中ERα36分子表达量明显增高，同时HER2下游相关p-ERK、p-AKT等蛋白表达水平较对照组明显升高，说明在生理浓度的雌激素作用下，ERα36可能通过激活HER2介导的ERK和AKT途径，参与肿瘤细胞的相关生物学作用。
使用慢病毒转染SKBR3细胞，下调ERα36后发现：在下调ERα36的细胞中，乳腺癌细胞增殖能力降低、凋亡增加，并增强对Herceptin处理的敏感性。同时，p-HER2、p-ERK、p-AKT等HER2信号通路相关蛋白表达降低。提示ERα36可能介导了HER2/AKT/ERK信号通路的激活，并通过HER2/AKT/ERK信号通路的激活促进Herceptin耐药。
1.探索雌激素(E2)对HER2+/ER-/PR-的乳腺癌细胞系SKBR3相关生物学特性的影响。
2.研究ERα36对HER2表达及其信号通路和相关生物学特性的影响。
3.研究ERα36是否通过激活HER2信号通路影响Herceptin的敏感性。
【方法】
1.使用无酚红培养基培养SKBR-3乳腺癌细胞株，同时使用不同浓度的雌激素处理对其进行处理，从而探索雌激素受体阴性的SKBR3细胞对不同雌激素浓度的反应。
2.细胞划痕实验以及CCK8测定不同浓度的雌激素对SKBR3细胞增殖迁移等能力的影响。
3.WesternBlot检不同浓度雌激素处理以后SKBR3细胞ERα36、ERα66、p-HER2、HER2、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK等相关蛋白的表达情况。
4.构建三组不同序列ERα36敲减慢病毒，转染SKBR-3细胞，嘌呤霉素筛选出稳定低表达ERα36的SKBR-3细胞株。
5.采用RT-QPCR检测不同序列ERα36的下调效率。
6.采用AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡，CCK8、Transwell等检测细胞迁移侵袭能力。
7.采用细胞爬片HE染色、细胞免疫化学等检测ERα36下调细胞的生物学特性。
8.WesternBlot检测稳定低表达ERα36的SKBR-3细胞株ERα36、ERα66、p-HER2、HER2、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK等相关蛋白的表达情况。
9.使用CCK8检测稳定低表达ERα36的SKBR-3细胞株对Herceptin的敏感性。
【结果】
1．使用不同浓度雌激素(E2)作用于在雌激素受体阴性的乳腺癌细SKBR3细胞中，通过分析划痕实验、CCK8、WesternBlot等实验检测结果，有以下发现：
(1)低浓度(1nM)雌激素促进肿瘤细胞增殖迁移，低浓度雌激素可有模拟生理浓度的作用，划痕实验以及细胞增殖实验均提示促进乳腺癌细胞增殖迁移。
(2)高浓度(5uM)抑制其生长，划痕实验以及细胞增殖实验均提示抑制乳腺癌细胞增殖迁移。
(3)WesternBlot实验结果显示，低浓度雌激素处理组ERα36、p-ERK、p-AKT等指标表达含量增高，而ERK、AKT总表达量无明显改变。
2.HER2阳性乳腺癌细胞系中，下调ERα36可以抑制乳腺癌细胞增殖、转移、分的能力。
(1)下调ERα36的乳腺癌细胞株sh-RNAERα36-SKBR3与野生型SKBR3细胞相比较，应用CCK8技术测得其增殖能力明显下降，培养过程中可以明显观察到其增长速率慢，Transwell可明显观察到迁移能力下降。
(2)应用AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡，发现sh-RNAERα36-SKBR3与野生型SKBR3细胞相比较凋亡率明显增加。
(3)WesternBlot检测ERα36下调乳腺癌细胞株sh-RNAERα36-SKBR3与野生型SKBR3细胞相比较P-HER2、P-AKT、P-ERK等磷酸化指标表达含量明显降低，然而HER2、AKT、ERK表达总量无明显变化。
3.使用HER2靶向治疗药物Herceptin处理野生型SKBR3以及下调ERα36的乳腺癌细胞株sh-RNAERα36-SKBR3。
(1)下调ERα36以后其对靶向治疗药物Herceptin的敏感性增加，CCK8增殖实验可观察到下调ERα36较野生型SKBR3实验组增殖情况下降。
(2)说明下调ERα36使其对HER2靶向治疗药物Herceptin敏感性较高。
【结论】
在雌激素受体阴性且HER2阳性的乳腺癌细胞(SKBR3)中，发现低浓度的雌激素可促进其增殖迁移，而高浓度的雌激素则会抑制这一过程。并且在WB检测中发现低浓度雌激素处理的实验组中ERα36分子表达量明显增高，同时HER2下游相关p-ERK、p-AKT等蛋白表达水平较对照组明显升高，说明在生理浓度的雌激素作用下，ERα36可能通过激活HER2介导的ERK和AKT途径，参与肿瘤细胞的相关生物学作用。
使用慢病毒转染SKBR3细胞，下调ERα36后发现：在下调ERα36的细胞中，乳腺癌细胞增殖能力降低、凋亡增加，并增强对Herceptin处理的敏感性。同时，p-HER2、p-ERK、p-AKT等HER2信号通路相关蛋白表达降低。提示ERα36可能介导了HER2/AKT/ERK信号通路的激活，并通过HER2/AKT/ERK信号通路的激活促进Herceptin耐药。