SHOX2基因表达和甲基化在肺腺癌中的临床病理意义

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【目的】
  1.利用TCGA数据库(TheCancerGenomeAtlas,肿瘤基因组图谱数据库),分析SHOX2基因mRNA表达和甲基化在肺腺癌(Lung Adenocarcinoma,LUAD)中的临床病理联系,为该生物标志物的临床应用提供理论依据。
  2.利用WB检测SHOX2及其相关蛋白在不同EGFR突变亚型的肺腺癌细胞中的表达,为分析SHOX2与EGFR突变、P53和RASSF1A的相关性,为该基因的基础分子研究提供理论依据。
  3.在H1975中利用siRNA技术下调SHOX2表达后,检测相关蛋白表达水平、转移能力和凋亡变化,分析SHOX2缺失后对肺腺癌细胞生物学特性的影响,为该基因促癌功能的研究打下基础。
  【方法】
  1.基于TCGA数据库,通过UALCAN在线分析工具研究了SHOX2mRNA表达和启动子甲基化与LUAD患者临床特征之间的关系。
  2.基于TCGA数据库,使用Wanderder线上分析SHOX2基因在肺腺癌组织和癌旁正常组织的甲基化情况。
  3.基于TCGA数据库,通过UALCAN在线分析工具基于TCGA数据研究了SHOX2启动子甲基化与LUAD患者临床特征之间的关系。
  4.基于TCGA数据库,使用LinkedOmics和MEXPRESS工具分析了SHOX2高表达与DNA甲基化、拷贝数变异的相关性。
  5.通过提取核酸,采用ARMS-PCR法检测LUAD细胞常见的驱动突变(包括EGFR、KRAS等),采用MSP-PCR发检测RASSF1A、SHOX2甲基化情况。6.常规体外培养LUAD细胞,Westernblot检测EGFR、P53、RASSF1A和SHOX2蛋白表达水平,并分析其关联。
  7.设计针对SHOX2基因特异性siRNA并瞬时转染H1975细胞,通过PCR法和Westernblot法验证在H1975细胞株中成功下调SHOX2。
  8.通过transwell实验、流式细胞术检测H1975细胞在下调SHOX2后在迁移能力和凋亡方面的变化。
  【结果】
  1.SHOX2在LUAD肿瘤组织高表达,且其表达水平随着年龄、T分期、N分期提高而增高,表明SHOX2与预后差有关。
  2.SHOX2在LUAD肿瘤组织低甲基化,且在LUAD早期甲基化水平较晚期高,表明SHOX2甲基化检测可作为肺癌早期诊断标记物。
  3.在肺腺癌中,SHOX2表达量与启动子和第1外显子中的DNA甲基化呈弱负相关(-0.1<r<-0.3,P<0.001),但与基因体和3’UTR区中的DNA甲基化呈中弱强度正相关(0.1<r<0.5,P<0.001)。此外,SHOX2表达量与基因拷贝数中等强度正相关(r=0.325,P<0.001)。
  4.与EGFR野生型肺腺癌细胞株相比,SHOX2和P53在EGFR突变肺腺癌细胞中明显高表达(P<0.05),提示SHOX2和P53高表达与EGFR突变易感性密切相关。
  5.H1975细胞下调SHOX2后侵袭转移能力减弱和凋亡增强。
  【结论】
  1.SHOX2在肺腺癌组织中高表达和基因低甲基化,与肺腺癌的预后差有关。
  2.SHOX2甲基化检测可作为肺腺癌早期诊断标记物。
  3.SHOX2高表达与基因体和3’UTR区中的DNA甲基化正相关,且受基因拷贝数的影响。
  4.在肺腺癌细胞中,SHOX2高表达与EGFR突变和P53突变易感性密切相关。
  5.SHOX2可促进肺腺癌细胞侵袭转移和抑制凋亡。
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