本研究制备了一种针对16型人乳头瘤病毒(HPV,human papillomavirus)的治疗性 mRNA 纳米疫苗(mRNA nanovaccine)。首先将HPV16的致癌基因E6E7合成,将其插入真核表达载体PVAX1,构建PVAX1-E6E7重组质粒。将其转化至大肠杆菌TOP10中扩大培养,提取质粒,经XbaI单酶切制备线性化的DNA模板,体外转录成E6E7 mRNA。用同样的技术路线构建PVAX1-GFP重组质粒,制备GFP mRNA。其次,由于无处不在的RNA酶,本研究构建了一种阳离子脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles,LNPs),旨在保护mRNA疫苗不被降解,顺利进入细胞,经过溶酶体逃逸后抵达核糖体翻译抗原蛋白。首先以GFP mRNA作为报告基因摸索mRNA-LNPs保护递送系统的条件。通过倒置荧光显微镜观察发现GFP mRNA-LNPs在293细胞中的荧光表达量相比化学转染法显著增加。随后将E6E7 mRNA与LNPs自组装成HPV mRNA-LNPs纳米疫苗。通过ELISA检测发现,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗在体外293细胞中的抗原表达量相比化学转染HPV mRNA的抗原表达量增强了 1.8倍。本研究通过动态光散射、电位、包封率等对纳米疫苗进行了探讨,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗的粒径约为97 nm左右,PDI为0.137,电位为21mV、包封率为95.9%。随后,将E6E7致癌基因通过两端的BamhI和XhoI酶切位点克隆到Pet-28a表达载体上,构建Pet28a-E6E7,将其转入BL21菌株进行诱导表达,分别用不同浓度IPTG诱导E6E7融合蛋白,确定最佳诱导条件为:16℃,120rpm,O.1mMIPTG诱导20h。将诱导得到的包涵体蛋白进行变性再复性获得E6E7可溶性蛋白,通过Western Blot鉴定目的条带以及结合活性。结果表明,本研究纯化的E6E7融合蛋白具有良好的结合活性,为后续动物实验检测奠定基础。最后,构建治疗小鼠模型,比较LNPs、HPV mRNA-LNPs、HPV DNA-LNPs的肿瘤生长曲线、小鼠血清抗原特异性IgG抗体滴度、Th1型细胞因子TNF-α、IFN-y、和Th2型细胞因子IL-4的表达情况以及各组小鼠脾细胞T细胞亚群变化。结果表明:相对LNPs对照组,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗组小鼠的肿瘤大小得到显著抑制(p<0.05),抗体滴度升高,细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4表达量均显著提高(p<0.01)。HPV mRNA-LNPs纳米疫苗组小鼠脾细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞相对LNPs对照组均显著提高(p<0.05)。综上所述,本研究构建的HPV mRNA-LNPs纳米疫苗在小鼠体内产生了显著的肿瘤治疗效果,诱发了强烈的体液免疫以及细胞免疫应答。