论文部分内容阅读
瘤胃是反气动物的一个重要消化器官,其中含有丰富的微生物资源,主要包括细菌、真菌、原生动物等多种微生物,约90%左右为未培养微生物。瘤胃中生白质的降解提供了反气动物40%的氮源,因此瘤胃具有复杂的蛋白酶系,以完成蛋白质的降解。与多糖降解酶相比,瘤胃中蛋白质降解酶类的研究相对较少,足一个有待挖掘的良好资源。因此,本研究利用宏基因组技术,从由羊瘤胃中筛选具有新颖特性的蛋白酶类。实验室前期构建了山羊瘤胃宏基因组文库。本论文利用功能驱动筛选策策略,以脱脂牛奶作底物筛选文库,获得了两个阳性克隆：R-P-1和R-P-2。以酪蛋白为底物的SDS-PAGE蛋白酶谱分析,发现R-P-1能产生1条蛋白酶活性带,R-P-2则能,产生3条蛋白酶降解带。对阳性克隆插入序列进行末端测序分析发现其氨基酸序列与GenBank的已有序列一致性较低,显示其新颖性。对R-P-1和R-P-2进行全序列测序。经注释,在R-P-1上发现了1个丝氨酸蛋白酶编码基因(ISP1).在R-P-2上发现了4个丝氨蛋白酶编码基因(2SP1-2SP4)和1个肽酶编码基因(2P)另外这些蛋白质序列与数据库中已知序列相比,同源性较低。经过构建蛋白质进化树分析,发现各蛋白酶与同家族的已知蛋白酶进化关系较院,独立成分支,进一步说明各蛋白酶的新颖性。蛋白酶组分的亚细胞定位预测显示各蛋白酶大都定位在胞外或细胞外膜,这些有利于它们对胞外蛋白质分子进行降解。R-P-2上4个丝氨酸蛋白酶基因,其编码的蛋白酶都属于Peptidase_S8家族,然而在序列上又存在着一定的差异,推测其功能上具有一定互补性,以协同高效地完成胞外复杂蛋白质的降解。以阳性克降R-P-2的培养液制备粗酶样品,测定显示其中的蛋白酶具有较广的pH耐受范围。粗酶液经60%饱和硫酸铵沉淀、Q-XL柱离子交换层析和Superdex7510/300GL柱分子筛层析后,SDS-PAGE检测显示初步分离到两个具有蛋白酶活性的组分RP2a和RP2b,LC-MS/MS鉴定RP2a为2SP1,RP2b为2SP3。为进一步开展酶学性质研究奠定了基础。