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药物-蛋白质非共价相互作用是药物发挥药效的重要途径,其作用方式和结合力大小往往决定了药物利用率和生物活性的高低。深入阐明二者之间的分子作用机制,对于理解药物在体内的转运过程和临床上快速筛选候选药物和生物标记物至关重要,一直是生命科学、药学和医学中的热点。但是目前缺乏合适的分析方法来动态全面的评估药物-蛋白质非共价作用,成为该领域发展过程中的瓶颈。常压质谱(Ambient mass spectrometry,AMS)是质谱领域近年来的前沿技术,装置简单、无须样品前处理,且具备在线检测和高通量的优势,大大推动了药物-蛋白质相互作用机理的研究进程。特别是冷喷雾常压质谱(Cold-spray mass spectrometry,CSI-MS)非常“柔软”的离子化方式,能更好的保持溶液中生物大分子的天然构象和分子间弱相互作用,使动态研究药物和蛋白质的非共价作用成为可能。本论文主要构建了基于冷喷雾常压离子源检测药物和蛋白质相互作用及蛋白质构象变化的新方法,内容如下:一、建立了酚酸与溶菌酶(Lysozyme,Lys)非共价相互作用研究的CSI-MS新方法。该方法不仅可真实的表征酚酸与Lys形成的非共价复合物,而且可获得蛋白质构象变化和详细的非共价结合参数等信息,为全面评估酚酸和Lys的结合过程和深入阐明酚酸生物活性提供了数据支持。我们首次采用CSI-MS和MS/MS技术,结合多光谱和理论计算的研究策略,建立了气相状态下酚酸与Lys的非共价复合物结构组成、稳定性,酚酸与Lys作用亲和力大小的表征方法。得到了酚酸与Lys的作用亲和力顺序(4,5-CQA>RA>1,3-CQA>CQA)和结合常数。同时应用荧光光谱静态淬灭机制测定了液相状态下酚酸与Lys作用亲和力的大小,证实其结果与采用CSI-MS气相检测一致;通过CD和FTIR光谱均显示酚酸改变了Lys的二级结构,使?螺旋含量增加,说明蛋白结合位点附近的色氨酸疏水性增加,引起了蛋白构象变化;分子对接研究进一步揭示了结合位点和作用力类型,佐证了CSI-MS的实验结果。上述结果均表明我们建立的CSI-MS方法是可靠的,可为药物作用机制研究提供新的技术支撑。二、建立了胰淀素蛋白(Islet amyloid polypeptide,IAPP)聚合物及其抑制剂非共价相互作用研究的CSI-MS新方法。该方法不仅可实现对IAPP亚稳态聚合物的在线检测和结构解析,而且可用于体外快速筛选IAPP抑制剂,为II型糖尿病的药物研发提供了新手段。我们首次采用CSI-MS技术对IAPP聚合物中间体进行了表征,通过与ESIMS的比较证明CSI的离子化方式更加柔和,并考察不同实验条件(缓冲盐、有机溶剂和p H)对于聚合物测定和蛋白质构象稳定性的影响。CID-MS/MS实验表明IAPP奇电荷二聚体的结构由两个单体产物组成,且主要是非共价解离。此外,我们还首次探索建立了筛选IAPP抑制剂的CSI-MS方法并应用于黄酮类化合物的IAPP抑制剂研究,从中筛选出两种最有潜力的IAPP抑制剂(芦丁和槲皮苷)。同时深入研究了黄酮类化合物与IAPP的非共价结合机制及构效关系,结果表明黄酮结构中的3-OH与糖链是活性基团,氢键在结合中发挥了主要作用。并采用荧光光谱和TEM实验进一步验证了筛选出的芦丁和槲皮苷可有效抑制IAPP淀粉样纤维的形成,证明了CSI-MS方法的准确可靠。本研究拓展了CSI-MS在淀粉样蛋白聚合物及其抑制剂开发方面的应用,也为阐明黄酮的抗淀粉样机制提供了新思路。