背景肥胖及2型糖尿病等胰岛素抵抗相关疾病已成为威胁全球的公共健康卫生问题。流行病学调查显示,我国成人糖尿病患病率已达10.4%,糖尿病前期状态更是高达35.7%。环境改变与疾病的关系越来越受到学界关注,胰岛素抵抗与环境的相关性甚至超过其与基因易感性的关系。研究发现,光污染、睡眠时间和/或质量的减少及倒班工作等引起的生物钟紊乱,可直接诱发胰岛素抵抗。且可以预见的是,随着我国社会工业化的不断推进,国民对24h消费服务的需求将不断增加,昼夜节律改变将持续普遍存在。然而,其机制未明。因此,针对性地研究生物钟对胰岛素敏感性的影响及探寻有效干预手段无疑为胰岛素抵抗相关疾病寻求新的突破,对我们这样一个处于社会转型,生物钟紊乱普遍存在且胰岛素抵抗相关疾病极速蔓延的国家具有重要意义。近年来microRNAs(miRNAs)在影响胰岛素敏感性中的作用备受关注,被证实可参与调控胰岛素产生、分泌及调节胰岛素靶器官功能等多个生理过程。此外,存在于外泌体中的miRNA可作为信号分子对特定的靶器官细胞传递信号。肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞来源外泌体miR-155可介导胰岛素抵抗的发生,提示外泌体miRNAs可作为胰岛素抵抗相关疾病的治疗靶点。值得关注的是,国外研究显示与ZT2(Zeitgeber Time,开灯时间记为ZTO)组相比,小鼠肝脏ZT14组 miR-140-5p、miR-185-5p、miR-328-5p 和 miR-326-5p 表达显著增加,提示miRNA表达具有明显的节律性。基于此,我们推测外泌体miRNA可能是生物钟紊乱介导胰岛素抵抗的新机制及根结所在。综上所述,我们拟采用24h持续光照干预小鼠,构建生物钟紊乱小鼠模型。评估小鼠全天活动模式、骨骼肌生物钟核心基因蛋白及mRNA表达及节律变化,从而明确持续光照对生物钟系统完整性的影响。同时,我们进一步观察骨骼肌代谢特征、脂质沉积及胰岛素敏感性变化。此外,提取小鼠血浆外泌体,行miRNA测序和生物信息学分析并初步验证,为进一步的机制研究及临床制定干预措施奠定基础。第一部分持续光照对小鼠骨骼肌肌纤维重塑及胰岛素敏感性的影响目的环境光污染、睡眠时间和/或质量下降、轮班工作等导致的昼夜节律紊乱与胰岛素抵抗密切相关。然而,其具体机制尚未明确。本研究采用24h持续光照成功构建生物钟紊乱模型,观察其对骨骼肌代谢特征及胰岛素敏感性的影响,并探讨其内在联系。方法本部分采用不同光照干预小鼠,随机分为以下2组:正常光照组(LD);24小时持续光照组(LL)。通过CLAMS代谢笼观察小鼠活动模式,ELISA法检测尿6-MSL的变化来明确持续光照对生物钟系统完整性的影响。每4个小时提取骨骼肌一次,观察骨骼肌生物钟核心基因蛋白及mRNA表达及节律变化。此外,运用Western blot及实时荧光定量PCR、组织免疫荧光及MRI等技术手段观察各组小鼠胰岛素敏感性及骨骼肌脂质沉积的变化,评价各组小鼠骨骼肌脂肪和葡萄糖代谢情况及肌纤维的变化。结果1.与正常光照组相比,持续光照小鼠静息-活动的昼夜节律特征明显退化,周期亦出现变化,且日间活动量和夜间活动量分别有增加和减少的趋势,但差异无统计学意义;夜间尿6-SML水平降低,差异具有统计学意义。2.持续光照10周后,小鼠骨骼肌核心生物钟基因Bmall、Clock、Per2、Rev-erbαmRNA表达水平及节律发生改变,Bmall、Clock、Cry1及Per2蛋白表达水平及节律发生改变,差异具有统计学意义。3.持续光照10周后,LL组小鼠体重增加13%,血清游离脂肪酸、甘油三酯及胆固醇水平增加,差异具有统计学意义。4.持续光照小鼠IPGTT、IPITT曲线的整体趋势及曲线下面积显示大于正常对照组,骨骼肌p-Akt/Akt水平降低并出现脂质沉积。5.免疫荧光显示LL组小鼠骨骼肌慢肌纤维比例降低,快肌纤维比例增加。实时荧光定量PCR显示LL组慢肌纤维基因标志物My12、Myh7及TnnilmRNA表达降低,而快肌纤维基因标志物Myh1mRNA表达增加。6.相较于LD组小鼠,LL组线粒体生物发生相关基因PGC1α、Tfam、Cox2及脂肪酸氧化关键酶Fatp1、Cpt1b mRNA表达显著降低。而脂肪酸合成酶Fasn及糖酵解过程限速酶Pkf1 mRNA表达水平较对照组显著上调。结论1.持续光照破坏小鼠生物钟系统的完整性,且导致骨骼肌生物钟基因表达水平及节律发生改变。2.持续光照促进小鼠骨骼肌脂质异位沉积及胰岛素抵抗的发生。3.持续光照小鼠骨骼肌代谢特征发生改变,肌纤维类型重塑,慢肌纤维比例降低;骨骼肌脂肪酸氧化功能受损,脂肪合成及糖酵解功能增强。第二部分持续光照对血浆外泌体miRNAs表达谱的影响目的昼夜节律紊乱可介导小鼠胰岛素抵抗,且外泌体miRNA可能在该过程中发挥关键作用,然而机制未明。本研究收集小鼠生物钟紊乱条件下血浆外泌体行miRNA测序。探寻生物钟紊乱背景下外泌体miRNA表达谱的变化并行初步验证,为明确外泌体miRNA在生物钟紊乱介导胰岛素抵抗发生发展中的具体作用机制奠定基础。方法提取各组小鼠血浆外泌体,Western blot检测外泌体特异性蛋白、透视电镜观察形态及NTA法检测外泌体粒径分布验证外泌体是否提取成功。进一步行外泌体miRNA测序,并借助生物信息学对差异miRNAs进行GO分析、KEGG Pathway分析,采用Real-time PCR对差异表达miRNAs行初步验证。结果1.Western blot结果显示外泌体特异性蛋白CD9、CD63及Alix在LD及LL组中均有表达。此外,透射电子显微镜下可见明显茶托状膜性囊泡,直径在50～120nm之间。NTA结果提示两组颗粒大小分布均在50～200nm之间,平均粒径约为140nm。2.与正常光照小鼠相比,持续光照小鼠血浆外泌体miRNAs有24条发生了显著变化。其中,显著上调的miRNAs数为17条,显著下调miRNAs数为7条。进一步对差异表达的miRNAs进行双聚类分析发现两组小鼠血浆分泌的外泌体具有较好的重复性,且分类明显。3.LL-exosome中表达差异的miRNAs所靶向的基因生物过程类别中主要富集在生物过程、信号转导及G蛋白偶联受体信号途径。细胞组件类别中较多富集在膜、膜组成成分及质膜。分子功能类别中靶基因主要富集在转移酶活性、蛋白质结合、嗅觉受体活性。4.KEGG分析一共反馈了 71个相关通路信息,其中,靶基因显著富集在磷脂酰肌醇信号系统、不饱和脂肪酸的生物合成、FoxO信号通路、胰岛素信号途径、2型糖尿病、丙酮酸代谢、AMPK及胰岛素抵抗信号通路等代谢途径。5.持续光照上调血浆外泌体及骨骼肌miR-22-3p、miR-376a-3p表达,下调miR-223-3p表达;此外,持续光照下调血浆外泌体miR-425-5p表达,上调骨骼肌 miR-425-5p 表达。结论1.生物钟紊乱导致小鼠血浆外泌体miRNAs表达谱发生改变;2.miRNA-22、miR-223、miR-376及miR-425在生物钟调控胰岛素敏感性过程中可能发挥关键作用。