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随着分子生物学在基因工程中的发展利用,基因工程已经成为获得转基因植株的一项重要工具,它对当代农业的发展意义深远。在转基因技术中,应当阐明外源基因的功能和相关调控机制,以及它们在植物中的表达位点和表达水平。另外由于外源基因在植物中的表达需要通过结合转录因子进行调节,因此鉴定外源基因的启动子及启动子上调控元件的功能是至关重要的。本实验室已有研究表明拟南芥β-葡萄糖苷酶19(Beta-glucosidase,BGLU19)基因启动子能够驱动外源基因在种子部位特异性表达,证明它是一个种子特异性启动子。与此同时对At BGLU19启动子的全长序列进行分析,鉴定出很多与其表达相关的顺式作用元件。在这些参与种子特异性表达的顺式作用元件中,RY元件与种子特异性表达密切相关。绿色荧光蛋白(GFP)是一类生物发光蛋白,它可以代替GUS基因作为转基因植物的一种分子标记。因此在本次研究中,使用GFP基因作为报告基因,设计了At BGLU19启动子序列上三个RY元件的突变序列,然后通过突变引物的PCR扩增得到了RY元件突变的启动子片段,继而连接到植物表达载体上。利用农杆菌介导的浸花法将上述表达载体转化至拟南芥中,并对转基因拟南芥进行了连续筛选,进而得到转基因纯合株系。此后检测GFP荧光以及用半定量RT-PCR方法对AtBGLU19启动子上的RY元件进行功能鉴定。本论文的主要实验结果如下:(1)AtBGLU19启动子及各RY元件序列分析。利用Plant CARE软件分析全长AtBGLU19启动子获得各RY元件位点,存在RY1、RY2和RY3三个RY元件。(2)AtBGLU19启动子上突变不同位点RY元件的表达载体的构建。通过PCR对RY元件定点突变,随后对其扩增产物进行电泳检测,电泳条带符合预期则酶切,随后回收酶切条带连接到植物表达载体上。最后经过测序结果比对,表明三个突变片段的植物表达载体均构建成功。根据其RY元件在AtBGLU19启动子上的不同位置,将得到的不同位点的RY元件表达载体依次命名为pMUTRY1-GFP、pMUTRY2-GFP和pMUTRY3-GFP。(3)将三个植物表达载体分别导入根瘤农杆菌GV1301中,继而通过农杆菌介导的浸花法来获得转基因拟南芥植株。经过潮霉素抗性筛选和分离比筛选来获得T3代转基因拟南芥纯合株系。(4)对得到的T3代转基因拟南芥植株的种子检测其GFP荧光活性进行定性分析,结果表明不同位点的RY元件突变后使AtBGLU19启动子驱动GFP基因在种子中的表达下调,且下调程度不尽相同,说明RY元件对AtBGLU19启动子在种子中的转录活性具有重要作用。pMUTRY1-GFP、pMUTRY2-GFP以及pMUTRY3-GFP的种子检测到的荧光与野生型启动子的种子检测到的荧光强度相比,出现了不同程度的减弱。将这三个突变启动子进行对比,其中pMUTRY1-GFP转基因株系种子的荧光强度最强,其次是pMUTRY2-GFP,最弱的为pMUTRY3-GFP。通过荧光强度说明pMUTRY3-GFP此处位点的RY元件对于AtBGLU19启动子驱动GFP基因在种子中表达所起到的正调控作用是最强的,其次是pMUTRY2-GFP和pMUTRY1-GFP。(5)对得到的T3代转基因拟南芥植株的种子用半定量RT-PCR方法进行定量分析,电泳结果表明相对于野生型启动子而言,三个突变启动子中pMUTRY1-GFP转基因株系的GFP表达量最高,其次是pMUTRY2-GFP,GFP表达量最低的是pMUTRY3-GFP。通过结合GFP活性以及半定量RT-PCR的结果可以得出以下结论:在AtBGLU19启动子中,起主要正调控作用的是RY3元件,其次是RY2和RY1。