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多重耐药菌和耐药基因的流行对野生动物保护和公共卫生安全构成了严重威胁。细菌耐药性和耐药基因对大熊猫迁地保护所造成的危害日益凸显,研究证实大熊猫源大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia,KP）存在抗生素耐药性,但是关于不同年龄组大熊猫肠道菌群的耐药性及肠道内条件致病菌肺炎克雷伯菌的多重耐药性、耐药机制和水平传播机制的研究尚属空白。基于此,本文以成都大熊猫繁育研究基地的圈养大熊猫为研究对象,开展以下两个方面研究:一是宏基因组学分析四个不同年龄组大熊猫肠道菌群耐药基因（Antibiotic resistance gene,ARGs）的差异以及ARGs和菌群结构的关联,客观评价了耐药基因对圈养大熊猫造成的健康风险;二是分析了多重耐药（Multi-drug-resistant,MDR）KP的耐药谱、ARGs和可移动基因元件（Mobile genetic elements,MGEs）的流行特征,并对其多重耐药和水平传播机制开展研究,为减缓耐药菌和耐药基因的传播提供参考。1.基于宏基因组学的大熊猫肠道菌群耐药基因研究通过宏基因组测序方法,从宏观角度对来自成都大熊猫繁育研究基地的幼年、亚成年、成年、老年四个不同年龄组60只大熊猫肠道菌群携带的耐药基因进行了综合研究。结果:（1）ARGs的总相对丰度、排名前20的ARGs亚型中的16种及介导对不同种类抗生素（除了磷霉素类）耐药的ARGs丰度,均表现为老年组和幼年组显著高于成年组和亚成年组,与大熊猫肠道变形菌门（Proteobacteria）菌群丰度在四个年龄组的变化一致。（2）四个不同年龄组之间的MGEs总数量均无差异显著性（P＞0.05）;基于获得的两组NMDS坐标进行Procrustes分析,确定ARGs与不同年龄组肠道中的微生物群落显著相关（P＜0.05）。（3）抗生素外排为最主要的耐药机制,主要由变形菌门主导。上述结果表明,不同年龄组大熊猫的肠道菌群携带了大量多样化的ARGs,并与菌群结构组成显著相关,存在水平传播风险。2.大熊猫源多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药性和分子分型研究采用培养基鉴别培养、革兰染色与镜检、生化鉴定和16S r DNA测序对成都大熊猫繁育研究基地圈养的94只不同年龄和性别的大熊猫在四个季节采集的376份新鲜粪便进行了KP分离和鉴定,通过纸片扩散法（K-B法）对MDR菌株进行筛选,利用高通量荧光定量PCR技术评估MDR KP菌株的ARGs,通过PCR分析了其MGEs和整合子/基因盒携带情况以及菌株的多位点序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）。结果:（1）从376份新鲜粪便中共分离到182株KP,进一步筛选到30株MDR KP菌株。（2）30株MDR KP分离株主要对β-内酰胺类耐药,其占比与季节显著相关;同时对头孢曲松等抗生素的耐药性与年龄和季节显著相关。（3）30株大熊猫源MDR KP中,鉴定出1株产ESBLs菌株,基因型为bla TEM+bla CTX-M-1+bla SHV;鉴定出3株产碳青霉烯酶,基因型为blaKPC（2株）和blaKPC+bla NDM-1（1株）。（4）在30株MDR菌株中,共发现了50种不同类型、共671个ARGs,前十位ARGs分别为:van TC-02、aac C、bla CTX-M-04、bla SHV-01、bla SHV-02、amp C-04、bla OXY、tet D、bla TEM和tet A-02;共检测到13个MGEs,其中IS26（96.67%）和int I1（96.67%）频率最高,tra A、tra F、tns A、IS1133、ISa7、ISkpn6、int I2和int I3未检出。（5）对整合子的进一步研究表明,在Ⅰ类整合子中检测出两种特定基因盒（dfr A12+orf F+aad A2和dfr A12+orf F）;MLST分型显示,30株多重耐药KP分离株属于22个STs,主要类型为ST37（5/30）,ST37有两个单位点变异。以上结果表明,大熊猫种群中已经出现MDR KP,且耐药性随季节、年龄、抗生素种类有所不同;MDR KP还携带了大量多样的ARGs,包括部分产ESBLs或碳青霉烯酶的ARGs,这些ARGs在大熊猫种群中存在水平传播威胁,因此临床需要更加合理使用抗生素,并应采取有效的监测和严格的生物安全策略来防止多重耐药菌株的传播。3.基于全基因组测序的大熊猫源肺炎克雷伯菌的多重耐药和水平传播机制研究采用全基因组测序对产ESBLs-MDR-KP（KP1）、产碳青霉烯-MDR-KP（KP2）、MDR-KP（KP3）、非MDR-KP（KP4）四株分离菌株进行ARGs种类、数量、位置的比较和分析。结果:（1）四株菌染色体基因组上携带的耐药基因一样,均为24种、25个ARGs;在质粒数量方面,KP4携带2个质粒,而KP1、KP2、KP3分别携带3个、1个、1个质粒;在质粒携带耐药基因情况方面,KP1、KP2和KP3质粒基因组上有8～11种、8～21个ARGs亚型,而KP4质粒基因组上仅1个ARGs,说明KP1、KP2和KP3的多重耐药性主要由质粒携带的耐药基因决定。（2）进一步结合四株KP的耐药表型和基因型发现,耐药表型和耐药基因型相符合:产ESBLs酶由质粒上的耐药基因CTX-M-1和TEM-1介导、对氨基糖苷类抗生素耐药是由质粒上的耐药基因AAC（3）-IIa和（或）APH（3’’）-Ib介导、对大环内酯类抗生素耐药由质粒上的耐药基因mph A介导、对四环素类抗生素耐药由质粒上的耐药基因tet（59）和（或）tet（C）介导、对磺胺类抗生素耐药由质粒上的耐药基因sul1和（或）sul2介导。综上表明,大熊猫源肺炎克雷伯菌的多重耐药表型及产ESBLs主要由质粒上的耐药基因介导,并且耐药基因有水平传播威胁。结论:（1）大熊猫种群的ARGs与其肠道菌群组成存在显著相关性。（2）大熊猫源KP中已存在多重耐药菌株,主要对β-内酰胺类抗生素耐药;MDR KP的占比与季节显著相关,对头孢曲松等抗生素的耐药性与年龄和季节显著相关。（3）大熊猫源MDR KP分离株携带了大量多样化的ARGs和MGEs,存在水平传播威胁;部分菌株产ESBLs或碳青霉烯酶,或是其多重耐药机制之一。（4）KP分离菌株的多重耐药表型及产ESBLs主要由质粒上的耐药基因介导,并且耐药基因有水平传播威胁。