呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是引发婴幼儿下呼吸道感染及相关死亡的最主要病原体之一，几乎所有2周岁前的儿童都感染过RSV。每年由RSV感染引起的婴幼儿住院率就高达2.5-4％，造成严重的医疗负担。至今仍没有安全有效的RSV疫苗上市。　　唯一获准上市的抗RSV特异性药物是一株识别RSV融合蛋白（F蛋白）的中和单抗帕利珠(palivizumab，Synagis(@))，但由于价格高昂，只在部分发达国家和地区用于降低免疫缺陷及先天性心脏病等高危新生儿的感染风险。该抗体药物的限制性使用一方面表明RSV的F蛋白是有效的中和作用靶标;另一方面也说明该抗体的识别表位Ⅱ(siteⅡ)所诱发的中和效价不足，抗RSV研究亟需寻找到新的高效中和靶点。进一步的研究报道还显示出现有已知的抗RSV表位均定位于一种稳定态的融合后构象（post-fusion构象）上，而其中palivizumab所识别表位所诱发的中和活性最高。同时对于同属于副粘病毒科的副流感病毒(PIV)的研究提示，RSV的F蛋白可能还存在另一种亚稳态的融合前构象(pre-fusion构象)，这为抗RSVF蛋白新靶点的新型抗体的研究提供了新的线索。本研究旨在通过寻找识别F蛋白这种未知的亚稳态构象的高中和抗体，尝试发现高效预防RSV感染的新靶点。　　本论文首先以DNA疫苗载体递呈RSVF基因的复合免疫方案，在小鼠体内激起高中和滴度的抗体应答，之后筛选不能与post-fusion构象的F蛋白(post-F)反应的anti-RSV中和抗体，获得了3株新型单抗。进一步的体外评估结果显示其中单抗5C4的体外细胞模型中和效价达到palivizumab的50-100倍，且完全不与post-F蛋白反应。　　进一步本论文通过将5C4 Fab段基因与F蛋白基因（切除C端膜锚定区）共同转染HEK293 GnTI-/-细胞，从细胞表达上清中纯化获得了5C4 Fab-F蛋白的复合物。通过电子显微镜检测5C4 Fab-F蛋白复合物显示在5C4 Fab存在的条件下，F蛋白呈现出一种完全不同于post-F蛋白的构象，暨RSV F蛋白的亚稳态pre-fusion构象。进一步的复合物晶体结构解析证实了该亚稳定构象（pre-fusion构象）的存在，解构了亚稳定的pre-F蛋白的结构，鉴定了5C4所识别的新靶点Site a。新型抗体5C4所识别的表位位于F蛋白pre-fusion构象的顶部，由来源于F2片段的a.a.63-74及F1片段上a.a.200-213组成。新表位包含的肽段在pre-F或者post-F蛋白上的构象发生明显的变化。来源于F1及F2的两个片段在post-F蛋白上定位于空间上相互远离的两个位置，这也正是新型抗体与post-F蛋白不反应的主要原因。同时结构解析还指示出5C4结合的F1残基靠近F蛋白的融合肽段(FP)，当5C4与亚稳态的pre-F蛋白结合后，抑制了F蛋白的结构变化，导致融合肽段不能够插入靶细胞膜，这可能是5C4能够有效的中和RSV感染的主要原因之一。　　最后本论文通过真核重组表达构建具有完全相同Fc段的抗体，对新型抗体5C4与上市抗体palivizumab的原型鼠源抗体1129进行了一系列的体内外性质比较（包括pre-F、post-F蛋白的反应性检测、病毒及病毒感染细胞的检测、体外中和活性检测、体外抑制病毒扩散检测、体内的预防性及治疗性评估等），从而平行比较了新靶点Site(o)与经典靶点SiteⅡ的应用潜力。反应性检测结果显示5C4和1129与纯化的pre-F蛋白结合的亲和力相当。此外二者均识别病毒感染的细胞上的F蛋白，然而在检测与病毒粒子表面F蛋白的反应时发现，1129的反应性明显高于5C4。该结果提示在病毒粒子表面，F蛋白很可能主要以post-fusion构象形式存在，而在病毒感染的细胞表面却存在大量的pre-F蛋白，表明在病毒离开细胞后表面的多数亚稳定的pre-F逐步的变构成post-F。功能性检测结果显示5C4的中和活性是1129的至少50倍以上，但抑制病毒扩散的能力却是1129的4倍左右（取决于感染后的加入时间）。进一步的小鼠模型上预防性实验结果显示出，5C4仅需1129用量的1/10就能有效预防RSV的感染。而在小鼠模型上对5C4和1129的治疗性进行评估，结果却显示二者在等剂量下，均对疾病的发展有一定的控制效果，但二者的效价差异没有在预防性实验中这么明显。首先，该结果显示出识别新靶点的5C4在预防效果上有着明显的优势，提示该新型抗体具有产业转化并替代原有抗体palivizumab的潜力。但同时体内外结果均提示，在抑制病毒的扩散或治疗上，5C4相较于1129的优势并不如在中和及预防上这么明显。这与不同构象的F蛋白在细胞及病毒表面的分布有一定的潜在关系。pre-F蛋白是介导病毒-细胞膜融合的具有功能性的F蛋白，anti-F的抗体对病毒的中和作用主要是通过抑制F介导的膜融合过程来完成的。而在病毒粒子的表面，F蛋白主要以post-F形式存在，用于介导膜融合的pre-F蛋白则隐藏在大量的post-F之中，因此抗体中和病毒感染的过程中，特异性识别pre-F的5C4具有更准确抑制pre-F变构介导融合的能力。而当病毒完成感染后，被感染细胞会呈现出大量的pre-F蛋白，这可能消耗掉了细胞上清中或小鼠血循环中的抗体，从而同时减弱了两类抗体的抑制效果，也使得两类抗体间的差异减小。这可能是造成这一现象的潜在原因之一，也是5C4具有更强中和活性的一个可能原因。　　综上所述本论文获得了抗RSV的新型高效中和抗体，并通过该抗体发现了F蛋白的全新亚稳定构象，发现了新的抗RSV的新靶点。新抗体与新靶点与原有上市抗体及已知靶点相比具有明显的效价优势。本论文还进一步的探索了新抗体及新靶点高中和效价的潜在分子机制，为新一代高效低成本RSV预防性药物的开发，以及在高中和表位的基础上为RSV疫苗的分子设计奠定了基础。