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目的:为开发新的靶向多肽药物,用于过表达EGFR的人类肿瘤分子成像和靶向治疗,设计,合成三种PEG修饰的多肽,通过体外细胞实验和体内研究,筛选到合适的多肽。方法:(1)本实验室设计了三种EGFR靶向多肽,以靶分子EGFR的膜外结合域为多肽序列主结合区,在多肽的一端,连接3个分子的PEG,以增加其亲水性和分子柔性,加入三个重复的酪氨酸残基,作为EGFR受体酪氨酸蛋白激酶进行磷酸化的底物,提高与EGFR受体亲和力和结合力,减低其受体激活效应,同时也为进行放射性碘的标记保留三个标记位点,有利于标记。另外,荧光团FITC连接到赖氨酸残基的侧链氨基上。三种PEG修饰的肽分别命名为SPW,Pep4和Pep6。通过HPLC-MS鉴定了三种PEG修饰的肽的纯度。(2)运用Western blot和细胞免疫荧光检测人口腔表皮样癌KB细胞和鼠成纤维L929细胞EGFR的表达量;CCK-8实验检测三种多肽对KB细胞和L929细胞存活、增殖的影响;共聚焦显微镜观察三种PEG修饰的多肽对KB细胞和L292细胞的结合亲和力。将三种PEG修饰的多肽与KB细胞膜的结合位点与EGFR单克隆抗体的免疫荧光结合位点进行比较,定位多肽与KB细胞结合位置。共聚焦显微镜断层荧光扫描,观察多肽在胞内分布。(3)小鼠皮下注射KB细胞建立人口腔表皮样癌细胞株皮下荷瘤鼠模型;三种多肽经尾静脉注入小鼠体内,在IVIS Spectrum小动物活体成像仪中进行成像,采集90分钟、120分钟、150分钟小鼠荧光图像,观察肿瘤部位荧光信号,筛选在肿瘤部位具有明显信号分布的多肽。经过初步筛选,Pep4被选择进行下一步研究。经尾静脉注射Pep4多肽,在0分钟、30分钟、60分钟、70分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟采集荧光图像,进行光谱分离数据处理,观察Pep4随时间在小鼠体内荧光信号分布;按上述时间点采集肿瘤部位与正常组织荧光信号ROI值,定量分析计算Pep4在不同时间点的T/NT比值。结果:(1)成功合成三条多肽,它们的氨基酸序列是(NH2)PEG3-X-X-X-X-X-Tyr-Tyr-Tyr-Lys(FITC)CO-NH2[SPW],(COOH)Ser-X-X-X-X-X-Tyr-Tyr-Tyr-Lys(FITC)-PEG3(NH2)[Pep4],X-X-X-X-X-X-Tyr-Tyr-Tyr-Lys(FITC)-PEG3(NH2)[Pep6],三条多肽的纯度均超过97%。(2)荧光成像和western blot电泳条带均证实KB细胞EGFR高表达,L929细胞EGFR低表达;不同浓度处理的KB和L929细胞的存活率无明显变化(p≥0.05),三种PEG修饰的多肽都没有细胞毒性和细胞增殖作用;三种多肽均具有体外靶向性,对EGFR高表达KB、4T1和U251细胞的亲和力明显高于L929细胞;多肽与细胞膜上EGFR结合,可通过内吞作用,进入细胞胞浆和细胞核。(3)人口腔表皮样癌细胞株皮下荷瘤鼠模型建立成功,成瘤率100%;尾静脉注射SPW、Pep6后,在荷瘤鼠肿瘤结节部位没有明显的荧光信号,SPW和Pep6在体内的靶向性很差;而在尾静脉注射Pep4后,荷瘤小鼠的肿瘤结节部位有明显的荧光信号,注射后90-150分钟内可在肿瘤部位观察到最强的荧光信号,因为Pep4很快从血液和正常组织中清除,而血液和组织中的多肽是通过尿液排泄的,注射后90和150分钟,T/NT比分别达到15.68和30.89。注射后180至210分钟,由于Pep4完全清除,血液和正常组织中没有信号。结论:我们获得了适用于靶向成像和治疗过度表达EGFR肿瘤的PEG修饰多肽Pep4,它具有良好的溶解性,组织渗透性,亲和力,特异性,快速清除性能。它可能是潜在的靶向药物,值得进一步研究。