研究背景:肝移植是终末期肝病的有效治疗方法,目前肝移植术后诊断排斥反应主要通过穿刺活检进行,但是移植后部分患者凝血功能差,有很大的风险。能否用一种简单和有效的方法检测肝脏排斥反应的程度和做出对应的处理,对移植后患者的长期预后至关重要。目前在肝移植排斥反应方面可以通过肝内基因进行排斥反应程度的诊断,在皮肤移植排斥反应方面因为移植皮肤可以通过表面观察,大多在症状出现后进行对症治疗,在联合移植方面发现通过在小肠移植同时移植皮肤,可以使用移植的皮肤预测小肠排斥反应,而肝脏与其他器官的排斥反应相关性未见报道,皮肤移植和肝移植排斥反应的相关回归关系尚待解决。第一部分门脉优先反向吻合快速建立肝移植大鼠模型研究背景:传统“二袖套法”大鼠肝移植模型的建立时间长,训练难度大,难以适应目前研究生的培养模式。目的:利用大鼠肝移植模型建立步骤多的特点,合理组合每一步骤的时间及方法,缩短学习时间,降低操作难度,快速地构建大鼠肝移植模型。方法:以“二袖套法”为基础,在保留下腔静脉血流通畅的基础上门静脉优先套管吻合,套管采用供肝放在大鼠下腹部的反向吻合法（门脉优先组）,建立大鼠肝移植模型,与传统大鼠肝移植模型（传统移植组）予以对比。结果:门脉优先组在学习时间上明显优于传统移植组。结论:门脉优先肝移植大鼠模型建立能缩短学习周期,降低操作难度,为初学者迅速掌握大鼠肝移植模型建立提供了一种可靠的方法,适合学习和推广。第二部分大鼠肝移植排斥反应RNA-seq分析及LCK、LAT、ZAP-70验证研究背景:肝移植术后排斥反应的防治仍是目前临床上的关键问题。目的:探讨大鼠肝移植排斥反应的病理生理机制,并挑选候选基因,为识别排斥反应程度及潜在的治疗靶点提供线索。方法:建立Brown Norway（BN）-BN的移植耐受模型（n=3）,Lewis-BN的移植排斥模型（n=3）,移植后7天获取标本,收集静脉血液进行肝功能检测,肝组织行HE染色及转录组测序技术（RNA-sequencing,RNA-seq）,对测序后差异基因筛选,KEGG、GO富集分析,实时定量PCR检测,确定RNA-seq结果的准确性,进行淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,LCK）、T细胞激活连接蛋白（T cells activate connexins,LAT）、ζ链（TCR）关联蛋白激酶70k Da（Zeta-chain（TCR）associated protein kinase 70k Da,ZAP-70）蛋白验证。结果:1、与耐受组相比,排斥组肝功能差;根据Banff评分,排斥组呈重度排斥反应状态,显示肝移植耐受和排斥模型已成功建立。2、在大鼠肝组织样本中,共鉴定了19186个基因,将排斥组与耐受组基因对比发现有7521个差异基因（Differential genes,DEGs）（p＜0.05）,其中6413个基因的异常变化（|log2（Fold Change）|＞1,p＜0.05）,其中排斥反应有3355个基因表达上调,3058个基因表达下调;KEGG结果显示有8条通路与免疫系统进程有关,其中上调基因中有7条富集,下调基因中有1条富集,进一步对其中的基因进行筛选,共289个基因,对其进行免疫基因谱同名比对（IMMPORT数据库）,筛选出147个免疫基因,发现有97个免疫基因|log2Fold Change|＞2,GO富集分析结果显示:上调基因参与了免疫反应进程,下调基因主要在代谢进程中起作用,在生物功能上参与了机体的防御反应。3、根据RNA-seq结果分析对部分基因的表达采用实时定量PCR（Realtime PCR,RT-PCR）验证,研究发现二者有类似的趋势,LCK、LAT、ZAP-70蛋白表达与RNA-seq结果一致,这些蛋白在排斥组的肝血窦和汇管区炎症细胞上呈阳性表达。结论:1、发现了CD86、C3、PROC、C5、LCK、LAT、ZAP-70等免疫排斥反应相关的基因可能导致肝移植排斥反应的发生。2、LCK、LAT、ZAP-70蛋白功能可能影响了肝移植排斥反应的进展,可作为检测肝移植排斥反应程度的候选标记物。第三部分皮肤移植排斥反应RNA-seq差异基因表达的筛查与分析研究背景:皮肤移植术后排斥反应程度的预测尚未有准确方法,如何能准确预测和诊断排斥反应的程度和发展,是目前亟待解决的问题。目的:通过建立大鼠皮肤移植模型,进行高通量基因测序,应用测序技术研究分析和寻找排斥反应的相关基因及诊断标志物。方法:建立Lewis-Lewis的皮肤移植耐受模型（n=4）,Lewis-BN的移植排斥模型（n=3）,移植后7天收集移植皮肤组织,进行RNA-seq测序,分析差异基因表达,对差异基因进行KEGG、GO富集分析,挑出诊断排斥反应的候选基因。结果:1、在大鼠皮肤移植组织样本中,共鉴定了20997个基因,将排斥组与耐受组DEGs对比,发现有5109个差异基因（p≤0.05）,其中1088个基因异常变化（|log2（Fold Change）|＞1,p≤0.05）,其中排斥组有734个基因表达上调,354个基因表达下调。2、通过KEGG通路富集分析,发现在上调基因通路富集中,有9条通路在免疫系统进程上富集,在下调基因通路富集中,有多数分别为信号转导、分子调控等通路上富集。3、GO富集结果证实了细胞黏附与排斥反应的进程有关。排斥反应可能的诊断标志物为粒酶B（Granzyme B,GZMB）、趋化因子CXCL9（Chemokine CXCL9）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（Cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4,CTLA4）。结论:皮肤移植RNA-seq测序发现了GZMB、CXCL9和CTLA4这3个免疫基因可能在皮肤排斥反应中起了重要作用,为移植后免疫排斥进行的进一步探索提供了依据。第四部分肝移植和皮肤移植排斥反应相关差异基因表达量的回归模型建立研究背景:简易和准确的检测对肝移植术后的排斥反应至关重要,而皮肤移植排斥反应和肝移植排斥反应是否相关以及其相关的关系尚不清楚。目的:探讨是否可以通过皮肤移植的基因表达来得出移植肝脏排斥反应基因的表达量,以指导肝移植排斥反应的诊治。方法:依据第二、三部分肝移植、皮肤移植RNA-seq表达差异基因进行同名基因比对,筛选出相同表达的差异基因,进行曲线估计,得出最优模型,建立回归模型。结果:同名对比分析显示,同时在肝移植急性排斥反应（Liver transplant acute rejection,LTAR）和皮肤移植急性排斥反应（Skin graft acute rejection,STAR）均有差异的基因有806个,发现排斥组差异基因表达量具有相关性,其相关系数r=0.795,R2=0.632,回归方程为:肝脏LTAR基因表达量=皮肤STAR基因表达量×6.914+233.484;进一步筛选其中的同名免疫基因为155个,行相关性分析,其r=0.940,R2=0.883,回归方程为:肝脏LTAR基因表达量=皮肤STAR基因表达量×6.119+431.467;同时为T细胞或巨噬细胞高度表达的基因16个,相关系数r=0.865,R2=0.748,回归方程为:肝脏LTAR基因表达量=皮肤STAR基因表达量×3.048+840.874。结论:通过移植皮肤的基因表达量能准确预测移植肝脏排斥反应基因的表达量,对肝移植排斥反应的诊治具有重要的指导意义。全文结论:1、门脉优先反向吻合技术为初学者迅速掌握大鼠肝移植模型的建立提供了一种较为快速可靠的方法,适合学习和推广。2、LCK、LAT、ZAP-70等在肝移植排斥反应中上调,可能在排斥反应中起到重要的作用。3、在皮肤移植中,GZMB、CXCL9和CTLA4等基因可能参与了排斥反应的免疫反应进程,并在其中起了重要作用。4、建立了皮肤排斥反应基因表达量和肝移植排斥反应的基因表达量的相关性回归模型,补充现有肝移植排斥反应检测的不足,为肝移植排斥反应的诊治提供理论依据。