镉处理下增施氮对杨树生长的影响及基因的差异表达分析

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镉是造成土壤和水体污染的一种主要重金属,对人类健康和生态系统的危害甚大。镉对植物毒害的作用机制和植物对镉污染土壤的修复是世界重金属生物学研究的热点问题。尽管对此的研究已有很多,但镉对植物产生毒害的真正原因和机制,至今尚不明确。从镉超富集植物的筛选标准来讲,杨树不是修复镉污染土壤的好材料,但其因极高的生物产量和超短的轮伐期能将土壤污染治理与生物能源生产结合,发挥很好的生态和经济效益,而成为一种用于土壤重金属修复的主要速生树种。为合理解释前人在实验中发现的在高浓度镉胁迫的同时增施氮能促进杨树生长的异常现象。本文以四川乡土杨树“川乡1号”(P.erlang shanensiscl.CN0728)扦插苗为实验材料,采用土培方式,共设对照(CK)、高浓度镉处理(Cd)、氮加镉处理(N+Cd)处理及氮处理(N)等四个处理,研究增施氮是否影响杨树生长及对镉的吸收;同时利用转录组测序技术(RNA-Seq),筛选镉处理和氮加镉处理差异表达的基因,确定外源氮是否诱导杨树耐镉基因的表达,为进一步耐镉基因的克隆、转移奠定基础,从而进一步明确杨树耐镉机制,为解决镉污染及镉污染土壤的植物修复理论提供依据。主要研究结果如下:(1)与CK相比,Cd处理显著抑制杨树的生长,株高、干重分别下降了 12.5%和20.5%;N+Cd处理下的杨树,生长得到显著的促进,株高、干重分别升高了17.3%和21.5%。说明高浓度镉处理抑制杨树的生长,增施氮可以缓解镉对杨树的毒害。(2)与单独Cd处理相比,N+Cd处理下,土壤中的Cd含量下降了 5.9%,叶片和根系中的Cd含量分别上升了 62.0%和98.4%。说明增施氮可以提高杨树对Cd的吸收和富集。(3)与CK相比,单独Cd处理下的杨树,叶片边缘变黄、焦枯,褪绿现象显著,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量显著降低了 9.1%、34.4%、14.9%。增施氮后,杨树叶色正常,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量显著升高了37.5%、30.8%、36.0%。表明高浓度镉处理显著抑制叶绿素的合成,尤其是叶绿素b的合成,而增施氮可以诱导叶绿素的合成,缓解镉对杨树的毒害。(4)利用HiSeq2000测序平台,分别对CK、Cd、N+Cd和N处理下的杨树进行转录组测序,分别获得48045828条、46712688条、46681202条和48076990条Clean reads。将得到的Clean reads进一步与杨树参考基因组和杨树参考基因序列进行比对,筛选不同处理样品之间差异表达的基因,结果显示CK-VS-Cd中有1355条基因上调表达,1945条基因下调表达;CK-VS-N中有581条基因上调表达,2638条基因下调表达;CK-VS-N+Cd中有1458条基因上调表达,1907条基因下调表达;Cd-VS-N+Cd中有1498条基因上调表达,1240条基因下调表达;N-VS-N+Cd中有1838条基因上调表达,341条基因下调表达。对得到的差异基因做GO功能显著性和KEGG Pathway显著性分析,确定这些基因行使的主要生物学功能和参与的主要生化代谢途径和信号转导途径,结果显示这些基因主要集中于144个代谢途径,其中与重金属离子转运和细胞内解毒相关的代谢途径有19个,主要集中于植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、抗坏血酸代谢、柠檬酸循环、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、过氧化物酶、ABC转运蛋白等代谢途径。在对Cd-VS-N+Cd的差异基因表达分析中,发现增施N后,SOD、CAT、GPX和APX等过氧化物酶对应的基因明显上调表达;谷胱甘肽合成途径中的关键酶基因谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)显著上调表达;此外增施N后,色氨酸、玉米素、油菜素内酯等促进植物生长,增强植物对逆境耐受力的激素类物质也得到显著的上调表达。该结果说明外源氮会诱导杨树耐镉基因的表达,也为进一步的耐镉基因的克隆、转移奠定了基础。
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