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鸡传染性贫血（Chicken infectious anemia,CIA）是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infection anemia virus,CIAV）感染引起的一类家禽免疫抑制病,以雏鸡再生障碍性贫血和胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩为主要特点。CIAV基因共编码三个蛋白,分别是VP1、VP2和VP3,其中VP2蛋白不仅是病毒的重要保护性抗原,而且在病毒感染致病过程中发挥重要作用。本研究基于CIAV的感染性克隆,对VP2基因相关的氨基酸位点进行定点突变构建CIAV突变株,并对突变株的致病性进行比较研究,为后续CIAV毒力致弱及机理研究奠定基础。本研究依据CIAV感染性克隆SD1520株的全基因序列,利用PCR突变方法对其VP2基因第101位氨基酸、VP2基因第161位和第162位氨基酸进行定点突变。突变后的CIAV SD1520株全基因组序列进行测序鉴定,结果表明SD1520株的VP2基因第101位氨基酸（精氨酸→甘氨酸）以及第161位氨基酸（天冬氨酸→甘氨酸）和第162位氨基酸（谷氨酸→甘氨酸）突变成功,分别命名为SD1520/101和SD1520/16。利用PCR分别扩增SD1520/101和SD1520/16全基因组,经T4连接酶进行环化后转染MDCC-MSB1细胞,进行病毒拯救并经间接免疫荧光试验以及测序鉴定拯救的CIAV突变株。结果显示,突变株转染MDCC-MSB1细胞经CIAV VP2多克隆抗体鉴定能够发出特异性的亮绿色,测序结果进一步证实CIAV的VP2基因第101位氨基酸以及VP2基因第161位和第162位氨基酸突变成功,其它位点没有发生突变。为了对CIAV基因组进行精确定量,针对VP2基因建立了荧光定量PCR检测方法,能特异性针对CIAV扩增出典型的“S”曲线,对马立克氏病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒均无反应,灵敏度比常规PCR方法高100倍,批内、批间重复实验的变异系数均小于2%,可同时快速和准确的检测大量临床产品,为CIAV的诊断和流行病学分析提供技术保障。为了验证突变株对鸡胚是否具有感染性,将突变株SD1520/101、SD1520/16病毒细胞上清液通过卵黄囊接种7日龄鸡胚,孵化至19日龄剖检采集胸腺、脾脏、骨髓等组织提取其DNA进行PCR检测,结果显示CIAV突变株的基因组分布在感染鸡胚的不同组织,进一步证实突变株感染性克隆构建成功。后续将突变株SD1520/101、SD1520/16接种1日龄SPF雏鸡进行动物感染试验,同时设立SD1520株攻毒对照组和空白对照组,在不同日龄对突变株在SPF鸡生长性能、HCT水平、免疫器官指数、抗体水平以及各组织器官病毒载量影响方面进行检测,剖检发现SD1520组、SD1520/101组、SD1520/16组均会使感染鸡出现免疫器官萎缩、骨髓黄化、胸肌和腿肌出血等临床症状,但是SD1520组发病症状最为严重,SD1520/101组、SD1520/16组明显低于SD1520组;SD1520组、SD1520/101组、SD1520/16组体重均低于空白对照组（P<0.05）,其中在14 d时,SD1520/101组、SD1520/16组体重高于SD1520组（P<0.05）;在14和21 d,SD1520/101组、SD1520/16组红细胞压积明显低于空白对照组（P<0.05）,28 d时红细胞压积值开始上升,但SD1520组在28 d时红细胞压积值依然低于空白对照组;SD1520组、SD1520/101组、SD1520/16组免疫器官指数低于与空白对照组（P<0.05）,其中SD1520组免疫器官萎缩最为严重,并且在14、28 d时,SD1520/101组、SD1520/16组免疫器官指数低于SD1520组（P<0.05）;SD1520/101组、SD1520/16组会显著抑制雏鸡对NDV和AIV-H9疫苗免疫诱发的HI抗体滴度（P<0.05）,但是SD1520/10组和SD520/16组的抑制作用低于SD1520组（P<0.05）;SD1520/10组、SD520/16组各组织器官病毒载量均低于SD1520组（P<0.05）,其中胸腺和骨髓的CIAV含量最高。综上所述,本研究成功构建了CIAV SD1520的VP2基因的相关氨基酸位点突变株,证实突变VP2基因第101位氨基酸、VP2基因第161位和第162位氨基酸会使CIAV复制能力减慢、致病性减弱,其中突变株SD1520/10致病性减弱最为显著,为进一步研究CIAV的致病机理奠定基础,也为研究新型基因疫苗候选株提供重要科学参考。