论文部分内容阅读
双生病毒是一类在全世界广泛发生的植物单链环状DNA病毒。其中菜豆金黄花叶病毒属病毒种类最多,危害最为严重,由其介体昆虫烟粉虱特异性传播。该病毒属病毒根据基因组的不同可分为单组份病毒和双组份病毒。双组份病毒包含两条单链环状DNA分子,DNA-A和DNA-B;单组份病毒仅包含一条单链环状DNA分子。部分单组份病毒伴随有DNA-β,称为β卫星分子。植物介导的菜豆金黄花叶病毒属病毒-烟粉虱互惠共生是造成植物病毒病流行以及烟粉虱暴发的原因之一。双生病毒β卫星分子编码的βC1蛋白可以通过与多种植物蛋白的互作抑制植物的防御反应,是影响双生病毒-烟粉虱-植物三者互作的关键因子。根据系统进化关系,双生病毒β卫星分子主要聚类成两个分支,分别从锦葵科植物和其它科植物中分离得到。目前,三者互作机制的研究大都集中于侵染茄科植物的中国番茄黄曲叶病毒卫星分子（Tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB）,而对侵染锦葵科植物的双生病毒（例如棉花曲叶病毒）的β卫星分子研究较少。木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV）是造成棉花曲叶病的重要病原物之一,其伴随的β卫星分子（Cotton leaf curl Multan betasatellite,CLCuMuB）和TYLCCNB属于不同的进化分支。本研究以“菜豆金黄花叶病毒属病毒-植物-烟粉虱”为研究体系,意在探索CLCuMuB和TYLCCNB在三者互作中的关键作用及其具体的分子机制。主要研究结果如下:（1）CLCuMuB和TYLCCNB辅助病毒侵染的特异性及其氨基酸序列的差异将CLCuMuV和TYLCCNV的两个卫星分子CLCuMuB和TYLCCNB进行互换后接种本氏烟,发现CLCuMuV/TYLCCNB和TYLCCNV/CLCuMuB均无法导致本氏烟病毒症状的显现。通过进化树分析和氨基酸序列比对,发现CLCuMuB和TYLCCNB属于不同的分支,并且序列差异很大。（2）CLCuMuBβC1是植物介导的CLCuMuV/CLCuMuB-Asia Ⅱ 1烟粉虱互惠的关键因子CLCuMuV/CLCuMuB主要由烟粉虱Asia Ⅱ 1隐存种高效传播。生测结果表明,Asia Ⅱ 1烟粉虱在被CLCuMuV/CLCuMuB侵染的普通烟和CLCuMuBβC1转基因普通烟上的存活率或产卵量显著高于对照组,而病毒粒子在烟粉虱体内并不会对其生存和繁殖产生直接的影响。Y形管嗅觉选择性实验表明,Asia Ⅱ 1烟粉虱成虫更趋向于被CLCuMuV/CLCuMuB侵染的普通烟以及CLCuMuBβC1转基因普通烟。此外,CLCuMuV/CLCuMuB和Asia Ⅱ 1烟粉虱的共侵染能显著提高普通烟水杨酸（SA）的含量。外施水杨酸甲酯（Me SA）能提高Asia Ⅱ 1烟粉虱在本氏烟上的存活率,反之外施茉莉酸甲酯（MeJA）降低了Asia Ⅱ 1烟粉虱的存活率。（3）CLCuMuBβC1通过与NtSBT1.7互作抑制植物对烟粉虱的防御本研究通过双分子荧光互补（BiFC）、pull-down、酵母双杂交等实验,证实了CLCuMuBβC1与烟草蛋白Subtilisin-like protease 1.7（NtSBT1.7）的全长互作。NtSBT1.7蛋白是一种丝氨酸蛋白酶,定位于植物细胞膜并主要在植物维管束组织中表达。NtSBT1.7启动子对下游基因的转录受到烟粉虱取食、机械损伤、MeJA外施的影响。生测实验表明,烟粉虱的产卵量在沉默NtSBT1.7基因的普通烟上显著高于对照组植株。同时NtSBT1.7正调控JA响应基因PDF1.2的表达。烟草富含羟脯氨酸系统素原（Nicotiana.tabacum prepro Hydroxyproline-rich Systemin B,NtpreproHypSysB）是烟草系统素前体蛋白。NtpreproHypSysB的转录可被烟粉虱取食强烈诱导。烟粉虱的存活率和产卵量在沉默NtpreproHypSysB基因的普通烟上显著高于对照组植株,且NtpreproHypSysB也正调控PDF1.2的表达。进一步实验表明,NtSBT1.7蛋白可与NtpreproHypSysB在植物体内发生互作,且该互作可被CLCuMuBβC1蛋白干扰。（4）TYLCCNBβC1通过与Nt SKP1互作抑制植物对烟粉虱的防御基于本课题组先前的研究结果,本研究通过GST pull-down实验再次验证了TYLCCNBβC1和烟草N.tabacum S-phase kinase associated protein 1（Nt SKP1）蛋白之间的互作。在沉默Nt SKP1基因的普通烟上,MEAM1烟粉虱的存活率和产卵量显著上升,且Nt SKP1正调控MYC2b和PDF1.2基因的表达。此外,Nt SKP1通过正调控转录抑制子JAZ1蛋白的降解来启动JA信号的转导,而TYLCCNBβC1通过与SKP1的结合,干扰了JAZ1蛋白的降解。综上所述,本研究证实了植物介导的“CLCuMuV/CLCuMuB-Asia Ⅱ 1烟粉虱”间接互惠机制,验证了CLCuMuB编码的βC1蛋白在该互惠机制中的关键作用。同时,揭示了不同进化分支的β卫星分子CLCuMuB和TYLCCNB编码的βC1蛋白与植物互作抑制植物对烟粉虱的防御反应的分子机制。我们的研究结果丰富了以CLCuMuV/CLCuMuB为核心的三者互作现象,为病毒病的流行和昆虫种群扩散提供了重要的生态学见解。此外,补充了β卫星分子在三者互作中的潜在分子机制网络,为作物抗逆分子育种研究提供了理论依据。