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本研究首先通过RT-PCR技术成功的扩增了GPMV的三段主要保护性抗原基因,并进行了克隆、序列的测定与分析。
本实验首先将克隆到pMD18-T的NP基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P的多克隆位点中,构建表达GPMVNP基因的原核表达载体pGEX-6P-NP。接下来将GPMV的F和HN分别亚克隆到含有禽痘病毒早/晚启动子LP2EP2的pSY538载体的EcoRⅠ酶切位点上,然后分别通过SmaⅠ或XbaⅠ酶切位点将带有P11启动子的LacZ基因也克隆到此载体上,最后将F和LacZ基因、HN和LacZ分别克隆到pSY681载体NotⅠ位点上,从而成功的构建了分别含有GPMVF、HN基因的重组禽痘病毒转移载体,分别命名为pSY681-F-LacZ和pSY681-HN-LacZ;为了构建双基因的转移载体,将带有LP2EP2启动子的F基因亚克隆到前面已构建好的pSY681-HN-LacZ载体的XhoⅠ位点上,即得到同时含有F和HN的双基因重组禽痘病毒转移载体。最后将GPMV能诱导宿主产生保护性免疫反应的主要抗原基因F、HN和NP作为候选基因,以具有CMV的启动子真核表达载体pcDNA3.1+作为载体,构建了含有以上三种基因的DNA疫苗。
本研究成功的克隆了GPMVJS/1/97/Go分离株F、HN、NP三段主要保护性抗原基因;利用基因重组技术构建了含有F、HN及双基因的重组禽痘病毒转移载体;对NP基因进行了原核表达和表达蛋白反应原性的检测;构建了含有GPMVJS/1/97/Go分离株F、HN、NP三种保护性抗原基因的DNA疫苗并进行了体外瞬时表达和动物体内接种试验。总之,通过本研究将为鹅副粘病毒病的诊断试剂和疫苗的研制提供科学的实验依据,奠定良好技术基础和物质储备。