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在心脏中,L型钙离子通道Cav1.2形成高分子信号复合体,这个信号复合体对于有效的信号传导非常重要,在这个信号复合体中有β肾上腺素受体,三聚体Gs蛋白,腺苷酸环化酶,PKA和PP2A。PP2A逆转了 PKA对Cav1.2白的磷酸化,降低Cav1.2的活性。PP2A是一种广谱的丝苏氨酸磷酸酶,其全酶包括催化亚基C,结构亚基A和调节亚基B。至少有十三种已知的PP2A的B亚基将PP2A核心酶靶向到各种亚细胞结构域或者细胞器,赋予酶的底物特异性或者调节酶的活性。Hall等在Cav1.2信号复合物中检测到PP2A B’家族的所有成员和PR59。这些B亚基在Cav1.2信号复合物中发挥的作用尚不清楚。近年来由于PP2A的调节亚基B的组织细胞表达差异及其在细胞中不同的分布模式,越来越受到重视,B’家族中B56α在心脏中具有最高表达,通过与ankryinB结合,主要分布在心肌细胞的M-line和Z-line,而Z-line又恰恰是Cav1.2高密度分布的区域,这无疑暗示着B56cα与PP2A参与的Cav1.2的磷酸化调节有着密切的关系。新近Little等报道在B56α+/-和B56α-/-小鼠中,B56α表达的减少导致心脏中PP2A的酶活的增强,表明B56α对PP2A的酶活发挥负调控作用。在B56α+/-心肌细胞中,PP2A酶活增强导致钙波和钙火花的减少。这同样暗示着B56α与PP2A参与的Cav1.2的磷酸化调节有着密切的关系。那么迫切需要回答的问题是:PP2A B56αα在PP2A所参与的Cav1.2的磷酸化调节中所发挥的作用是什么?为了回答这个问题,本课题主要从B56α与Cav1.2的相互作用方式和B56α在心肌Cav1.2信号复合物中的功能两方面结合生物学技术进行探究。B56α与Cav1.2的相互作用方式结论如下:1用成年小鼠心室肌裂解液和H9c2细胞裂解液进行IP,结果确认B56α存在于PP2A/C、Cav1.2免疫沉淀复合物中。2利用免疫荧光技术,在急性分离的成年小鼠心室肌细胞和初生的小鼠心室肌细胞对Cav1.2和B56a的共定位进行分析,结果显示,两者在Z-line处存在共定位。3通过分子克隆技术将Cav1.2 a1亚基的NT(1-154 aa),Loop1(436-554 aa)及CT(1505-2171 aa)克隆到载体pcDNA3.0-HA上,将这三个片段分别与B56α共转到HEK293中,通过co-IP,证明这三个片段都不与B56α结合。进一步深入的实验中,GST-B56α与PP2A/α敲除小鼠心室肌组织裂解液pull-down的结果显示,B56α与Cav1.2之间的相互作用依赖于PP2A/α。这些结果表明B56α并非与Cav1.2直接结合,而是通过与PP2A/α相互作用存在于Cav1.2信号复合物中。B56α在Cav1.2信号复合物中的功能结论如下:1在H9c2中过表达B56α,Western显示:B56α的表达量升高了近8倍,PP2A催化亚基Cα结构亚基A及B56家族的其他成员的表达量并没有发生改变。B56α的过表达抑制了 PP2A的活性。表明B56α是对于PP2A的活性有自抑制效应。2在本底条件下过表达B56α,伴随着PP2A活性的下降,Cav1.2的磷酸化水平升高了近2.5倍。3通过ISO激活肾上腺素能信号通路,发现B56α的过表达显著增强了肾上腺素能信号通路的效应,Cav1.2的磷酸化水平升高了近十倍多。4在HEK293中过表达B56α,同样B56α的表达并不引起PP2A其他亚基表达量的改变,B56α现出对PP2A酶活的自抑制效应。综上所述,本研究表明,心肌中B56α并非通过与Cav1.2直接结合的方式进行调节,而是通过与PP2A/Cα相互作用存在与Cav1.2信号复合物中。B56α对PP2A磷酸酶活性的调节依赖于与PP2A/Cα的相互作用,这种作用方式又是PP2A酶活自抑制效应的基础,进而调控Cav1.2的活性。