背景：IL-12家族成员不仅在感染及炎症过程中起着重要的调节作用,而且与脑脊髓炎、多发性硬化症、克罗恩病、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发病和治疗密切相关。白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)家族已发现4个：IL-12、IL-23、IL-27及其新成员IL-35。该家族每个成员均是由一个α亚基(p19,p28或p35)和一个β亚基(p40或Ebi3)组成异源二聚体,这样,IL-12家族成员在结构上相互交叉重叠(如下图所示)。根据IL-12家族成员分子异源二聚体构成特点,我们和其他研究者推测p28和p40,或者p19和Ebi3也能组成新的分子(如图所示)。虽然有研究已经显示p28和P40能构成新分子并具有抑制免疫反应的功能,但是研究者没能发现体内存在p28/p40复合物。因此,我们的研究重点为p19能否与Ebi3结合成新的细胞因子?如果能够结合,那么这种新型细胞因子在自身免疫性疾病中功能是什么?这样,我们就围绕新型细胞因子p19/Ebi3(我们命名为IL-39)的鉴定及在自身免疫性疾病系统性红斑狼疮中的作用和可能机制做了初步探究,力图为系统性红斑狼疮的致病机理提供依据、为该病的治疗提供新的可行性思路。目的：鉴定新型细胞因子IL-39 (p19/Ebi3)是否天然存在,探究其在自身免疫性疾病系统性红斑狼疮中的作用和机制。方法与结果：一、鉴定新型细胞因子IL-39及其受体、信号通路1.细胞因子IL-39 (p19/Ebi3)的鉴定：为了验证IL-12家族分子亚基p19与Ebi3是否能够相互结合形成复合物,我们通过蛋白表达、纯化等实验手段,结合PCR、免疫共沉淀、双抗夹心ELISA等方法检测不同细胞亚群是否表达p19/Ebi3复合物,,得出以下结果：(1)通过免疫共沉淀实验发现,人源和鼠源的p19、Ebi3均可以互相结合,构建表达载体并纯化p19/Ebi3复合物,经鉴定,p19/Ebi3复合物是54kD的异源二聚体,我们命名该复合物为IL-39；(2)通过PCR结果发现,RAW264.7细胞系、骨髓来源的树突状细胞等抗原提呈细胞存在p19、Ebi3共表达现象；(3)通过双抗夹心ELISA结果发现,RAW264.7细胞系的细胞培养上清中存在天然形式的IL-39 (P19/Ebi3);(4)通过双抗夹心ELISA结果发现,LPS活化的B细胞可分泌天然形式的IL-39 (p19/Ebi3);2、IL-39信号通路的鉴定：为了鉴定IL-39发挥生物学功能的信号通路,我们结合IL-12家族受体分子亚基配对规律,应用受体敲低、蛋白质印迹法、流式细胞术等方法检测IL-39的受体及其诱导STAT家族成员磷酸化,实验结果发现：(1)B细胞中表达IL-12家族的受体；随着LPS刺激时间增加,B细胞表面受体IL-23R、gp130的表达量增多；(2)IL-39可以促进B细胞中STAT1及ATAT3的磷酸化,而对其他STAT家族成员如STAT4、STAT5等无影响；当敲低IL-23R或gp130后,IL-39不能诱导STAT1和STAT3磷酸化。二、鉴定分泌IL-39的B细胞前面的研究已经显示抗原提呈细胞如DC、巨噬细胞和B细胞都有表达IL-39的能力。成熟或LPS活化的DC、巨噬细胞表达IL-39水平降低,而只有B细胞是活化后增强IL-39,显示了活化的B细胞分泌IL-39可能有病理意义而不成熟DC、巨噬细胞表达的IL-39可能有生理意义。我们认为研究IL-39的病理意义更大,因此详细地分析分泌IL-39的B细胞,我们设计了体内外实验：1)体外分离小鼠脾脏B细胞,用LPS刺激B细胞活化,通过PCR、流式细胞术、ELISA等不同方法研究活化B细胞表达IL-12家族5亚基的情况,同时抑制B细胞活化观察其表达情况；2)体内实验引用了B细胞异常活化的系统性红斑狼疮小鼠模型,通过流式细胞术、PCR等方法观察脾脏B细胞中IL-39的表达。实验结果主要有：(1)体外研究发现经LPS活化的B细胞(如GL7+B细胞)主要表达p19与Ebi3,双抗夹心ELISA法结果进一步证实了活化的B细胞可以分泌天然形式存在的IL-39；当用IFN-γ、Bcl-6抑制剂等抑制B细胞活化后,IL-39的表达量明显下降。(2)体内实验验证了系统性红斑狼疮小鼠发病后脾脏B细胞异常活化,与体外实验结果一致,体内异常活化的GL7+B细胞是产生IL-39的主要来源。三、鉴定IL-39在系统性红斑狼疮中的作用为了探究IL-39在系统性红斑狼疮中的作用,通过流式分选的方法的得到GL7+B细胞,然后用shRNA慢病毒感染的方法在GL7+B细胞中分别敲低IL-12家族的5个亚基,最后回输给未发病的系统性红斑狼疮模型鼠和CD19cre小鼠体内观察对病情发生发展的影响；另外,制备了抗IL-39多克隆抗体对系统性红斑狼疮发病鼠进行治疗，通过尿蛋白、抗体产生、肾脏病理等指标检测治疗效果。研究发现：(1)GL7+B细胞可诱导系统性红斑狼疮,出现尿蛋白升高、脾脏肿大、脾重增加、脾脏B细胞异常活化等,而给予敲低p19或Ebi3的GL7+B细胞的小鼠发病明显降低；(2)将抗1L-39多克隆抗体给予系统性红斑狼疮发病鼠后,病情缓解,出现皮肤溃疡缓解、尿蛋白下降、脾肿大减轻、脾脏异常活化的B细胞数目减少、抗体分泌减少、肾脏病理炎症程度下降等。四、分析1L-39在系统性红斑狼疮中的作用机制为了探究IL-39在系统性红斑狼疮中促炎作用的可能机制。通过体内外实验应用流式细胞术观察IL-39对T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞亚群的影响,并在方法三的疾病模型中进行反向验证。研究结果如下：(1)体内外研究表明IL-39可以促进中性粒细胞的分化发育；(2)敲低p19、Ebi3或抗体阻断IL-39后,中性粒细胞数目降低：(3)系统性红斑狼疮小鼠的中性粒细胞分泌致病因子BAFF;(4)通过体外实验,证明了IL-39可能通过IL-39-BAFF正反馈环促进系统性红斑狼疮小鼠中性粒细胞比例上升。结论：我们发现了IL-12家族亚基p19与Ebi3能组成新的复合物并命名为IL-39。系统性红斑狼疮样小鼠异常活化的GL7+B细胞可分泌高水平的IL-39。IL-39可以通过受体IL-23R/gp130诱导STAT1、STAT3磷酸化而发挥生物学功能。IL-39通过诱导中性粒细胞分泌B细胞活化因子(BAFF)等机制介导狼疮样小鼠炎症反应,而应用抗IL-39抗体等方法阻断IL-39的效应能有效地减轻狼疮样小鼠炎症反应和自身免疫症状。总之,在本研究中我们发现了介导炎症反应的IL-12家族新分子IL-39。随着深入研究IL-39在系统性红斑狼疮中的作用及机制,也许能为系统性红斑狼疮的治疗提供了新的思路和潜在应用价值。