永生化人脐带间充质干细胞对常见病毒的易感性研究

来源 :北京工业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:ADAM129XU
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脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)比骨髓来源的MSCs具有更强的扩增能力、免疫原性低,具有多向分化潜能、安全性好。因此MSCs在再生医学、基因治疗、细胞治疗、疫苗生产检定等方面具有广泛的临床应用前景。本课题组前期将人端粒酶催化亚基导入人脐带间充质干细胞(hMSCs),建立了永生化hMSCs,该细胞系具有体外定向分化的潜能、保持二倍体核型、表面标记符合MSCs特征且在小鼠体内无致瘤性。在此基础上,本研究检测该细胞系对痘苗病毒天坛株(VTT)、人巨细胞病毒(HCMV)、肠道病毒71型(EV71)、重组仙台病毒(rSeV-HIVgag)、重组腺病毒(rAd5-GFP、rAd5F35-GFP)及流感病毒A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)共6大类10个病毒株的易感性,为该细胞系的进一步应用奠定基础。  在实验中,使用不同剂量的病毒感染hMSCs,同时用病毒的易感细胞作为阳性对照,通过显微镜观察病毒致细胞病变效应(CPE)或报告基因表达的绿色荧光蛋白以及间接免疫荧光法检测病毒抗原的表达,判断病毒是否感染hMSCs;在此基础上,测定病毒可感染细胞的最低病毒量;通过结晶紫蚀斑法、实时荧光定量PCR法等来检测和比较感染细胞释放的病毒量。结果显示:VTT和HCMV感染的hMSCs出现明显的CPE;rAd5-GFP和rAd5F35-GFP感染的hMSCs可观察到绿色荧光;VTT、HCMV、rSeV-HIVgag、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)和A/Brisbane/10/2007(H3N2)感染的hMSCs可观察到病毒抗原特异性的绿色荧光,而EV71、A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)感染的hMSCs无可见的绿色荧光,说明hMSCs对前7个病毒易感,对后3个病毒不易感。最低感染复数结果分别(hMSCs/阳性对照细胞)为:1.5×10-5/1.5×10-5(VTT)、0.01/2×10-4(HCMV)、5×10-5/5×10-5(rSeV-HIVgag)、150/5×10-5(rAd5-GFP)、2/2×10-5(rAd5F35-GFP)、1/0.01(A/Brisbane/10/2007(H3N2))、5×10-4/5×10-4(B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)),说明hMSCs对不同种类的病毒株易感性差别很大,但其最低感染剂量普遍高于阳性对照细胞的。  对病毒感染后细胞释放的子代病毒进行检测时,发现等量VTT感染后48h、72h,测得hMSCs上清中VTT滴度为3.84±0.14、5.36±0.01lg PFU/mL,而对照细胞上清滴度为5.48±0.09、6.42±0.13lg PFU/mL;等量HCMV感染后4-8d,测得hMSCs上清中的HCMV DNA拷贝数分别为:3.92±0.07、4.24±0.02、4.41±0.01、4.78±0.06、4.73±0.12lgCopies/mL,对照细胞的上清拷贝数分别为4.06±0.05、4.07±0.05、4.55±0.02、6.02±0.03、6.90±0.01lgCopies/mL;等量B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)感染后1~3d,测得hMSCs上清中病毒HA分别为0、1∶2、1∶2,而对照细胞的上清HA均为1∶256。  综上所述,本研究初步研究了永生化hMSCs对常见6大类病毒中10个病毒株的易感性,并进一步分析比较了可感染的最低病毒量和病毒释放量,为其在疫苗生产检定、基因治疗、细胞治疗等方面的应用提供了实验依据。
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