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目的：结核分枝杆菌可以在人体内长期处于休眠状态,当人体免疫功能下降时恢复生长活性,引起活动性肺结核,这是结核病难以根治的主要原因。RpfD(复苏因子D)作为一种结核分枝杆菌休眠期分泌的蛋白,其主要作用在于促进休眠状态的细菌复苏,同时它能引起机体较强的免疫应答。作为结核分枝杆菌的特异性抗原之一,RpfD被发现对正处于复苏状态的结核分枝杆菌有较强的免疫活性。本研究在实验室前期筛选的结核亚单位疫苗ESAT6-Ag85B-Mtp64-Mtb8.4-HspX中融合插入RpfD的编码基因Rv2389c,构建新型结核亚单位多期融合蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX(EARMMH, LT84),以改善原有的结核亚单位疫苗的免疫原性,尤其是对复苏期结核分枝杆菌产生免疫作用。方法：通过对实验室己构建好的重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B-Mtp64-Mtb8.4-HspX加以改造,利用Bgl Ⅱ单酶切位点插入RpfD的编码基因Rv2389c,构建全新的重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX;经测序鉴定确认目的基因连接成功后,将重组质粒转入表达载体大肠埃希菌BL21中,选择适宜条件诱导表达重组蛋白LT84。目的蛋白的诱导表达条件为：温度34℃,IPTG终浓度0.5mmol/L,摇床180RPM,诱导时间4h。诱导表达结束后,利用蛋白电泳分析鉴定目的蛋白是否表达。纯化融合蛋白LT84时首先进行盐析,所得沉淀使用PB缓冲液重悬,然后使用GE公司蛋白纯化仪和疏水柱,进行上样蛋白样品的纯化,以获得目的蛋白LT84。得到纯化的蛋白样品后,使用分光光度计测量蛋白样品0D值推算浓度。结果：构建了重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX;测序鉴定无变异,利用BL21大肠杆菌表达载体在IPTG终浓度0.5mmol/L,34℃,摇床180RPM,诱导时间4h条件下成功诱导表达重组融合蛋白表达于上清之中。使用饱和硫酸铵溶液对目的蛋白进行盐析盐析浓度为2%,时间为12h；盐析所的产物使用蛋白纯化仪和GE healthcare疏水柱纯化,得到纯化的融合蛋白EARMMH(LT84)。经蛋白电泳鉴定后,使用酶标仪测定蛋白样品浓度为0.755mg/ml.结论：成功构建了重组质粒PET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX,并在适宜的条件下诱导表达融合蛋白EARMMH(LT84),使用盐析及疏水层析纯化了获得了目的蛋白,得到浓度为0.755mg/ml的重组融合蛋白EARMMH(LT84),为进一步研究结核亚单位疫苗提供了新疫苗和备选对象。