牦牛奶酪乳酸菌是我国重要而且独特的生物资源,有极其重要的收集、整理、保存、研究的价值。本研究从西藏、云南、新疆三个地区采集17份牦牛奶酪样品,分离纯化出了其中的乳酸菌,研究了乳酸菌的表型、基因型和益生特性。表型特性的研究即用传统的菌落形态、革兰氏染色显微形态、生理生化、在不同环境(温度、pH值、盐度)中的生长特生,碳水化合物发酵方式等实验项目,将乳酸菌划分到属,进而初步判断出菌种,此外,还分析了产酸活性、利用柠檬酸盐等表型特性,以获得乳酸菌的基本数据,基因型特性的研究包括16S rRNA序列分析和随机扩增多态性DNA技术。本研究建立了属特异性PCR→16S rRNA序列分析→种特异性PCR的快速鉴定模式,构建了系统进化树,以分析乳酸菌菌株的遗传亲缘关系。建立了适用于乳酸菌的RAPD反应体系和程序,用于分离鉴定出的乳酸菌,用NTsys2.10e软件对其图谱做聚类分析,与16S rRNA序列分析的结果相比较,分析菌株之间的遗传亲缘关系,分析菌株聚类方式与地域之间的相关性。益生特性的研究包括乳酸菌菌株的产细菌素、产胞外多糖、产叶酸、降胆固醇的益生特性,并研究了菌株对抗生素的抗性、体内环境的耐受性、黏附活性,筛选出有突出益生功能,抗逆性较好的菌株,有希望作为益生菌加以开发应用。主要的研究结果如下：(1)西藏、云南、新疆三个地区的样品平均pH值分别为4.31±0.39；4.69±0.29：4.52±0.22,地区之间不存在显著性差异(P=0.176>0.05),三个地区菌落计数平均值分别为4.17±0.43；4.30±0.68；3.9±0.59log CFU/g,也不存在显著性差异(P=0.468>0.05)(2)从17份样品中分离出39株乳酸菌,通过表型方法初步判断出菌种。35株菌为杆菌,被分为7个菌种：L.buchneri2株(Y15.Y16),L.casei16株(T7.Y19,X21,X22,X23,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X33,X34,X35,Y36)L.diolivorans3株(Y18,X24,X25),L.fermentum3株(T1,T2,T3),L.helveticus3株(T6,T8,Y9),L.kefiri3株(Y10,Y12,Y20),L.plantarum5株(T4,Y13,Y37,X38,X39)。4株菌为球菌,被分为2个菌种：Pediococcus acidilactici1株(T5),Pediococcus pentosaceus3株(Y11、Y14、Y17)。(3)本研究测出6株乳杆菌产酸活性达到了起酵菌株的标准：X24、X38、X29、X25、X21、X22。选出发酵柠檬酸盐活性较强的菌株有：T4、T7、Y10、Y13、X25、X28、Y36、Y37,这些菌株的优良特性是在长期适应环境、以及生产实践中积累形成的。(4)16S rRNA序列分析：将39株乳酸菌用16S rRNA序列分析法鉴定到种,并构建了系统进化树,进一步验证了菌种的划分,与表型特性是一致的。(5)随机扩增多态性研究：做出了39株乳酸菌的RAPD指纹图谱,除X23、Y36和Y37之外,其余菌株均按照不同的菌种聚类,与16S rRNA序列分析法得出的结果基本是一致的,菌株聚类方式与地域有较强的相关性,说明RAPD技术在分类鉴定中有一定的应用价值,可解析菌株之间的遗传亲缘关系。(6)检出31株菌产细菌素,菌株Y13能够拮抗5种致病菌：Bacillus cereus ATCC10876. Escherichia coli0157:H7、 Listeria monocytogenes、Citrobacter freundii ATCC8090、Salmonella Typhimurium ATCC13311,抑菌谱最宽X29和X30能拮抗4种致病菌：Bacillus cereus ATCC10876、Citrobacter freundii ATCC8090. Salmonella Typhimurium ATCC13311、Enterobacter cloacae ATCC23355。所有乳酸菌细菌素对嗜热链球菌Streptococcus thermophilus都没有拮抗活性,在发酵乳制品时,这些乳杆菌可与嗜热链球菌合用,相互之间没有拮抗作用。(7)筛选出产胞外多糖的菌株有T3、T4、T5、T7、T8、Y11、Y14、Y17、X29,用苯酚-硫酸法定量检测所有筛出菌株的产量,与文献报道的产量相比处于中等水平,最高产菌株T8产量为193.72mg/L。(8)筛选出9株菌可以产叶酸：T3、T7、T8、X23、X25、X26、X27、X29、Y37。最高产的菌株是Y37,总产量达到了85.98±5.09ng/ml,其次是X25,总产量为81.17±2.08ng/ml,与文献报道的产率17-100ng/ml相比,本实验筛选出来的菌株X25和Y37已达到了很高的产量。(9)研究了乳酸菌在MRS-CHOL培养基中对胆固醇去除率,Y15、X25和X27对胆固醇降解率分别为45.59%,50.01%和53.18%,都达到40%以上,与文献报道过的乳酸菌菌株相比属于比较高的水平。(10)用纸片扩散法测了39株菌对抗生素的抗性。39株乳酸菌对氨苄青霉素、氯霉素、红霉素敏感的菌株分别占74.4%；82.1%和82.1%,对萘啶酮酸、链霉素、万古霉素和新霉素有抗性的菌株分别占100%；97.4%；92.3%和82.05%。(11)对体内环境耐受性很强菌株有3株：Y15、X25和X27,粘附性也很好。(12)本研究鉴定并筛选出3株乳酸菌能耐受体内环境、有可能定植于肠道中,并有特定的保健功能,有可能作为益生菌开发。Y15(.L.buchneri)能产胞外多糖(50.26±1.25mg/L),降胆固醇(去除率为45.59%),对萘啶酮酸、链霉素、万古霉素有抗性。X25(L.diolivorans)能产叶酸(81.17±2.08ng/mL),能降胆固醇(去除率为50.01%),对萘啶酮酸、链霉素、四环素、万古霉素有抗性。X27(L.casei)能产胞外多糖(38.62±1.21mg/L),产叶酸(77.83±2.52ng/mL),能降胆固醇(去除率为53.8%),所产细菌素对Bacillus cereus ATCC10876, Staphylococcus aureus、Escherichia coli O157:H7有拮抗活性,对新霉素、萘啶酮酸、链霉素、万古霉素有抗性。本论文的创新之处在于(1)牦牛奶酪乳酸菌是我国重要而且独特的生物资源,有极其重要的收集、整理、保存、研究的价值。本研究是对牦牛奶酪中的乳酸菌进行的最完整、系统、全面的基础研究。(2)建立了属特性PCR→16S rRNA序列分析→种特异性PCR的菌种鉴定模式,可用于对大量野生菌株快速鉴定菌种,能有效提高鉴定效率和准确性。(3)构建了重现性好的RAPD反应体系和程序,用于乳酸菌菌株的基因分型,其聚类分析结果与16S rRNA序列分析法基本是一致的,说明它在乳酸菌的分类鉴定中有较好的区分效率,可与其它基因型鉴定方法结合使用,提高菌种的鉴定效率。菌株RAPD图谱聚类方式与地域之间有较强的相关性,可用于菌株原产地的分析,保护菌种资源。(4)从菌株中筛选出了三株有突出益生功能、抗逆性较好的菌株,有希望作为益生菌开发应用。