兔支气管败血波氏杆菌病是由波氏杆菌(Bordetella Bronchiseptica, Bb)引起的一种家兔慢性呼吸道传染病,该病病程较长,传播广泛,较难治愈,给养兔业带来了严重的的经济损失。目前预防该病的全菌灭活疫苗的保护力较低,急需研究新的疫苗候选成分,为该病的诊断和预防提供依据。外膜蛋白(Outer membrane proteins, OMPs)在抗药性、致病性、免疫原性等方面具有重要作用。本研究基于实验室前期在兔波氏杆菌外膜蛋白免疫蛋白质组学研究,通过生物信息学分析,挑选5个新发现的免疫原性蛋白做为靶蛋白,原核表达后免疫动物,结果显示外膜孔蛋白前体和假定的脂蛋白具有免疫保护性,为波氏杆菌疫苗有效成份分析提供依据,也为波氏杆菌新型亚单位疫苗的研发奠定基础。1.靶蛋白基因的克隆及序列分析基于实验室前期在兔波氏杆菌免疫蛋白质组学研究结果,通过生物信息学分析筛选了兔波氏杆菌5个具有免疫原性的蛋白(分别为假定的氨基酸ABC转运可溶性结合蛋白,ABC；赖氨酸/异亮氨酸/缬氨酸结合蛋白前体,BPP；保守的假定蛋白,CHP；可能的脂蛋白,PL；外膜孔蛋白前体,PPP)作为靶蛋白,参考GeneBank所公布的靶蛋白基因序列用Oligo6.24软件设计了5对特异性引物,PCR扩增出靶基因的全长序列,产物经电泳回收后与pMD-18 T载体连接,转化TOP10感受态细菌后,筛选出阳性克隆。采用碱裂解法提取质粒DNA,并进行双酶切和测序鉴定。测序结果表明,扩增的基因与参考序列的同源性均达97%以上,为靶基因的开放式阅读框核酸序列。2.靶蛋白原核表达及免疫原性分析本研究将成功构建的克隆载体和表达载体pET-28a(+)分别经双酶切处理后,进行连接转化,获取阳性的重组质粒。加入IPTG诱导后,成功表达了5个靶蛋白,条带大小：ABC蛋白为56.6 KD,BPP蛋白为39.7 KD,CHP蛋白为21.6 KD,PL蛋白为41.5 KD, PPP蛋白为41.3 KD,与预期大小相符。优化表达及纯化条件,对纯化的蛋白进行WB分析,结果表明获得的5个重组蛋白均能与兔支气管败血波氏杆菌阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫原性。3.重组蛋白免疫效果评价将表达的重组蛋白与等量的佐剂混合乳化后免疫小鼠,每组9只,免疫两次,每次间隔2周,首免前和首免、二免后10天各采血一次(随机选取五只小鼠),分离血清,间接ELISA方法检测抗体效价。二免后第14天,每组取8只小鼠,用浓度为1.74*107cfu/ml的波氏杆菌腹腔攻毒。结果表明二免后各试验组小鼠体内IgG抗体水平均达到了较高的水平,攻毒保护试验结果显示PPP蛋白和PL蛋白对小鼠的保护力较好,而ABC蛋白、BPP蛋白、CHP蛋白的保护力与对照组相差不大,PPP蛋白保护力62.5%,PL蛋白保护力50%,显著高于阴性对照组12.5%。对获得的免疫保护性较高的PPP蛋白与PL蛋白进一步进行抗体亚型分类检测,结果显示,PPP蛋白免疫组小鼠均产生了较高水平的特异性IgG1和IgG2a抗体,表明PPP蛋白既可刺激机体产生体液免疫反应,也可产生细胞免疫反应,但是特异性IgG1抗体水平高于特异性IgG2a抗体水平,说明PPP蛋白所诱导的免疫反应以Th2型为主导；PL蛋白和全菌蛋白免疫组小鼠主要产生了IgG1型抗体,而IgG2a型抗体较少,说明PL蛋白和全菌蛋白主要刺激机体的体液免疫反应,所诱导的免疫反应也是Th2型为主导。分别取PPP蛋白、PL蛋白、全菌蛋白免疫小鼠的脾脏,分离脾淋巴细胞,MTT法测定脾淋巴细胞增殖反应,并分别用蛋白刺激脾淋巴细胞,试剂盒检测淋巴细胞上清液ITN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。结果显示PPP、PL蛋白刺激后,能诱生INN-γ、IL-2、IL-4显著升高,全菌蛋白组升高不明显；PL蛋白诱生IL-10显著升高,PPP蛋白和全菌蛋白组升高不明显。抗体亚型分类检测证明PPP蛋白与PL蛋白在小鼠体内引起了较高的体液免疫,而且PPP蛋白可以在小鼠体内引起一定的细胞免疫；淋巴细胞增殖试验显示PPP蛋白与PL蛋白能有效刺激淋巴细胞增殖；细胞因子检测结果表明PPP蛋白与PL蛋白在小鼠体内能同时引起较高的细胞免疫和体液免疫。