多溴联苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是一类含溴原子的芳香族化学物,常作为阻燃剂加到油漆、塑料、纺织、电子电器等产品中,目前已广泛应用于电子、电脑和泡沫等家具中。随着工业的发展,PBDEs在世界范围的需求不断增加,环境中的PBDEs的浓度也逐年增多。有资料显示,发达国家80%的电子垃圾进入中国、印度和巴基斯坦等国,其中中国占了90 %,导致城市的户外空气中PBDEs浓度比农村空气中的10倍还多,在我国一些地区已形成了电子垃圾拆解集散地,原始的拆解手段(露天焚烧、烘烤和酸洗等)使PBDEs等持久性有毒污染物不断向周围释放,严重污染了当地环境,危害人体健康。由于PBDEs具有难降解性、环境稳定性、高脂溶性和生物放大作用,能够通过食物链的转移,使生物受到毒害,最终导致对人体健康的危害。目前国内外对低溴联苯醚的相关毒性研究较多,而且结果较肯定,从大量动物实验中发现低溴类PBDEs具有肝肾毒性、生殖毒性、甲状腺毒性、神经发育毒性及潜在的致癌性等,因此,在欧盟及美国已禁止使用。而十溴联苯醚(decabrominated PBDE, PBDE-209或DeBDE)的毒性较低溴联苯醚类低,在美国及欧洲仍允许生产使用。我国不但是PBDEs的生产、使用和出口大国,而且还是接收电子垃圾的大国,其中PBDE-209的生产使用量最大,因此PBDE-209已成为我国重要的环境污染物。PBDE-209在环境中可以经光解、高温分解、生物及微生物降解等过程,转化成溴二苯并二噁英、多溴二苯并呋喃及低溴代的联苯醚,更容易进入生物体,引起更强的毒性作用。但是,关于PBDE-209对机体是否存在危害仍有很多争议,研究证明PBDE-209具有神经发育毒性,免疫毒性,内分泌毒性以及致癌性;动物试验证实PBDE-209有胎毒性,在孕期接触PBDE-209,能使雄性子鼠的生殖功能受损。近年来卵巢癌发病率呈持续上升趋势,是女性死亡率最高的生殖系统恶性肿瘤。目前卵巢癌病因尚未明确,但遗传因素和环境因素交互作用对卵巢癌的影响已引起人们的关注。PBDE-209可影响女性生殖系统及内分泌水平(激素),而环境中日益增高的PBDE-209浓度与女性生殖系统肿瘤发病率的升高目前并无相关的报道。因此,本课题从细胞水平出发,深入研究PBDE-209对体外培养的卵巢癌细胞株OVCAR-3细胞和中国仓鼠卵巢上皮细胞株CHO细胞增殖的影响,观察低浓度PBDE-209暴露对癌细胞的增殖以及对细胞周期的影响,并初步探讨在这一过程中信号转导通路PKCα-ERK的磷酸化变化。第一部分PBDE-209对卵巢癌细胞和仓鼠卵巢上皮细胞体外增殖的影响【目的】观察低浓度PBDE-209暴露引起OVCAR-3和CHO细胞形态学改变;MTT法检测细胞生物活性的变化;免疫荧光化学检测增殖细胞核抗原Ki67的表达变化;并用流式细胞术检测PBDE-209引起的细胞周期的分布变化。【实验方法】(1)贴壁培养OVCAR-3和CHO细胞,连续计数接种后0-7天的细胞数,描绘三种细胞株的细胞生长曲线,并计算细胞群体倍增时间。(2)取复苏后2-3代OVCAR-3和CHO细胞为实验细胞,饥饿同步化处理后,加入不同浓度PBDE-209作用不同时间(0-72h),观察细胞生长形态变化;并用MTT法测定细胞吸光度值,计算细胞增殖率变化。(3)用免疫荧光化学方法,观察不同浓度PBDE-209作用于OVCAR-3和CHO细胞72h后Ki67的表达变化。(4)用流式细胞术检测不同浓度PBDE-209作用于OVCAR-3和CHO细胞72h后,细胞周期分布变化。【结果】(1)卵巢癌细胞株和仓鼠卵巢上皮细胞株在生长形态和特点上完全不同:OVCAR-3细胞胞体接近椭圆形且形态不规则,呈集落样生长,接触性抑制较差,细胞群体倍增时间是36.74±1.29 h;而CHO细胞胞体呈梭形,亦呈集落样生长,耐饥饿能力差,细胞群体倍增时间是40.56±1.25h。(2)随着PBDE-209作用时间的延长以及浓度的升高,细胞增殖明显,细胞间隙变小。MTT检测发现,PBDE-209引起两种细胞株细胞增殖率变化呈现时间依赖和浓度依赖效应。50nM作用于OVCAR-3细胞24h即可以引起细胞的增殖;作用48h时使细胞增殖率增加1.53倍;而72h的暴露可以引起细胞1.75倍的增殖变化。而CHO细胞对PBDE-209的反应相对较轻,100nM PBDE-209作用48h和72h时细胞增殖率分别为1.47倍和1.51倍,弱于OVCAR-3细胞。(3)免疫荧光化学观察发现0-100nM PBDE-209作用72h时,可以引起Ki67阳性细胞百分率变化呈现浓度依赖效应。25nM、50nM和100nM PBDE-209作用于OVCAR-3细胞Ki67阳性细胞百分率分别为82.14%,85.42%和92.16%左右;而在CHO细胞中,PBDE-209引起的Ki67阳性细胞无明显的表达变化。(4)流式细胞术检测发现,PBDE-209作用于OVCAR-3细胞和CHO细胞72h后,使两种细胞株G0/G1期细胞比例下降而G2/M期(OVCAR-3细胞)和S期(CHO细胞)细胞比例升高;100nM PBDE-209使OVCAR-3细胞G0/G1期细胞比例由80.25%下降至72.35%,而G2/M期细胞比例由3.95%上升为11.90%;对于CHO细胞而言,100nM PBDE-209分别引起了G0/G1期细胞5.10%的下降以及S期细胞5.20%的升高。【结论】0-100nM PBDE-209暴露于OVCAR-3和CHO细胞0-72h时,使细胞增殖率和Ki67阳性细胞表达率升高;并引起G0/G1期细胞比例的下降和G2/M期(OVCAR-3细胞)和S期(CHO细胞)细胞比例的升高。第二部分PBDE-209引起OVCAR-3和CHO细胞中PKCα/ERK磷酸化水平的变化【目的】观察PBDE-209在引起OVCAR-3和CHO细胞增殖过程中,PKCα和ERK信号转导通路的作用。【实验方法】用Western Blot方法观察0-100nM PBDE-209作用于细胞15min(浓度依赖实验)或者50nM PBDE-209作用0-120min(时间依赖实验),观察PBDE-209对OVCAR-3和CHO细胞中PKCα和ERK磷酸化水平的影响【结果】PBDE-209激活了PKCα和ERK的磷酸化,并呈现浓度依赖和时间依赖效应;但是在两个细胞株中,PKCα和ERK磷酸化达到峰值的时间和所需要的浓度有所差异。(1)浓度依赖实验:在OVCAR-3细胞中,随着浓度的升高,PKCα磷酸化水平增强,50nM时达到高峰,维持高水平至100nM;而ERK在25nM即可以出现明显的磷酸化,50nM时达到峰值,100nM时出现轻度下降,仍然高于阴性对照组;而在CHO细胞中,加入PBDE-209即可以激活P-PKC磷酸化,并且持续升高,50nM时达到高峰;ERK的磷酸化随着PBDE-209浓度的逐渐增高,其水平逐渐增强,在25nM时达到高峰,维持高水平直至100nM。(2)时间依赖实验:在OVCAR-3细胞中,作用30min即可以引起PKCα的磷酸化,60min时达到高峰,维持至120min;而作用15min即可以激活ERK的磷酸化,30min时达到峰值,并维持至120min;在CHO细胞中,作用5min时可以观察到PKCα磷酸化的激活,其水平逐渐增强,在120min时达到高峰;而当作用5min时同样观察到ERK磷酸化的激活,在60min时达到高峰。【结论】PBDE-209引起了OVCAR-3和CHO细胞PKCα和ERK的磷酸化,并且呈现时间依赖性和浓度依赖性。第三部分PKCα和ERK特异性抑制剂对PBDE-209引起的OVCAR-3和CHO细胞增殖的影响【目的】观察PKCα特异性抑制剂G?6976或ERK抑制剂PD98059对PBDE-209引起的OVCAR-3和CHO细胞增殖的影响以及细胞凋亡率的变化;并观察G?6976和PD98059对PBDE-209引起的PKCα-ERK磷酸化表达的影响。【实验方法】(1)免疫荧光化学定性方法观察G?6976或PD98059与PBDE-209联合作用72h后,Ki67表达变化;(2)流式细胞术定量观察G?6976或PD98059与PBDE-209联合作用72h后细胞凋亡率的变化;(3) Western Blot观察G?6976或PD98059预处理30min后,对PBDE-209引起的PKCα和ERK磷酸化的影响。【结果】(1)免疫荧光化学检测发现:与阴性对照组比较,G?6976或PD98059可以使Ki67表达强度下降,其中G?6976的影响比PD98059更加明显;而PBDE-209与G?6976或PD98059联合作用时,可以使Ki67表达强度增强,100nM的提升程度比50nM明显;但是均不能达到PBDE-209单独作用时Ki67的表达强度。(2)流式细胞术检测发现:G?6976引起OVCAR-3和CHO细胞的凋亡率分别为9.6%和17.5%,与阴性对照组比较均有统计学意义;而PD98059引起的两种细胞的凋亡率分别为3.25%和14.9%;当与PBDE-209联合作用时均可以使G(?)6976或PD98059引起的细胞凋亡率下降,100nM的下降效果比50nM更加明显,可分别使G(?)6976引起的细胞凋亡率在OVCAR-3和CHO细胞中下降5.25%和11.9%左右;而使PD98059引起的细胞凋亡率在OVCAR-3和CHO细胞中下降2.6%和12.1%。(3) Western Blot检测发现:单独PBDE-209作用于OVCAR-3和CHO细胞时,PKCα和ERK的磷酸化水平均增强,并具有浓度依赖性;而与阴性对照组比较,单独G(?)6976或PD98059作用于OVCAR-3和CHO细胞,均可以使PKCα和ERK的磷酸化水平下降,其中G(?)6976的影响比PD98059更加明显;而PBDE-209与G(?)6976或PD98059联合作用时,与单独PBDE-209处理组相比,PKCα和ERK的磷酸化水平亦明显下降。【结论】PBDE-209部分拮抗了G(?)6976和PD98059引起的OVCAR-3和CHO细胞的凋亡,进一步说明PBDE-209可以在一定程度上促进细胞的体外增殖;并且在这一过程中PKCα和ERK起到促进作用。