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研究背景及目的:肺癌位居我国恶性肿瘤发病率及死亡率首位,非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌总数的80%。大部分肺癌患者在确诊时已为晚期,已丧失手术根治机会。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）开启了晚期NSCLC靶向治疗的时代,可显著改善EGFR突变型NSCLC患者的无进展生存期（progression-free survival,PFS）和总生存期（overall survival,OS）。奥希替尼（osimertinib）是第三代EGFR-TKI,基于AURA研究和FLAURA研究,其先后获批用于经一二代TKI治疗进展后EGFR T790M突变阳性患者的二线治疗以及EGFR敏感突变患者的一线优先推荐治疗。然而,尽管EGFR-TKI疗效显著,其获得性耐药不可避免,因此探讨其耐药机制及应对策略具有重要的科学意义和临床价值。白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）是在感染和癌症中均发挥关键作用的细胞因子。在肿瘤微环境中,多种类型细胞（肿瘤细胞、免疫细胞等）均产生IL-6,癌细胞中IL-6/JAK/STAT3信号通路的激活可促肿瘤细胞存活及增殖、促血管生成、促肿瘤侵袭和转移,并抑制肿瘤细胞凋亡。既往有研究认为IL-6升高是第一代EGFR-TKIs的潜在耐药机制。然而,IL-6是否与奥希替尼耐药相关,尚不清楚。因此,本研究旨在通过系列体内、体外研究明确IL-6引起奥希替尼耐药的效应及机制,并通过小分子药物库筛选的手段寻找可能逆转IL-6诱导的奥希替尼耐药的策略。研究方法:1、RNA测序（RNA sequencing,RNA-Seq）对3组配对的奥希替尼敏感细胞（PC-9 cells、PC-9GR cells和H1975 cells）和耐药细胞（PC-9OR cells、PC-9GROR cells和H1975OR cells）进行了RNA-Seq,对敏感/耐药细胞的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）进行富集和交集分析,并绘制蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction,PPI）网络。2、临床数据及分析回顾性收集2014年3月1日至2020年12月31日在陆军军医大学大坪医院接受吉非替尼及奥希替尼治疗的有基线血清IL-6信息的晚期EGFR突变非小细胞肺癌患者的相关治疗信息。使用Graph Pad Prism 8.0进行统计分析,分析基线血清IL-6水平与PFS、OS的相关性,分析基线、疾病进展时IL-6动态变化,分析进展时IL-6水平与已知耐药机制的相关性。3、体外实验利用PC-9细胞、H1975细胞、PC-9GR细胞、HCC827细胞和H3255细胞以及相应的奥希替尼耐药细胞和过表达IL-6的PC-9细胞、PC-9GR细胞、HCC827细胞,进行ELISA、CCK-8实验、Ki67掺入实验、流式细胞术、蛋白质印迹法等实验,利用奥希替尼耐药患者的肿瘤组织切片进行免疫组织化学染色,探讨IL-6介导奥希替尼耐药的分子机制。4、体内实验将PC-9GROR（1×10~6/ml）细胞皮下注射到6周龄BALB/c A-nu小鼠中。5～7天后当肿瘤生长至约30 mm~3时,将小鼠随机分至不同处理组。每周测量2次瘤体长径（a）与短径（b）,瘤体体积=（a×b~2）/2,并测量小鼠的体重;4周后处死动物,收集血液标本,离心后取上清保存,进行ELISA检测对应样本IL-6浓度值。5、小分子药物筛选将IL-6-GFP接种于取96孔板,每孔接种3×10 ~3/ml个细胞。共铺板两组细胞,一组用于GFP荧光读取,另一组用于CCK-8实验检测细胞增殖。化学药物库购自Selleck（L2000,含510种化合物）,筛选时每孔加入浓度为10μM化合物处理48 h,用高内涵筛选系统（Molecular Devices,USA）分析GFP信号。用DMSO处理的细胞作为对照组,筛选出可抑制IL-6-GFP荧光且对细胞活性影响较小的化合物。结果:1、IL-6是引起肺癌奥希替尼耐药的关键机制之一。（1）多组配对的奥希替尼敏感及耐药细胞转录组测序富集及交集分析表明:IL-6是奥希替尼耐药前后差异基因相互作用网络中最核心的分子。（2）基线IL-6水平与EGFR-TKI疗效密切相关,IL-6水平高,则PFS、OS明显缩短。而且,无论是吉非替尼还是奥希替尼,耐药后IL-6水平均显著升高,且奥希替尼耐药后IL-6升高更明显。（3）进一步基础实验发现,在奥希替尼敏感的肺癌细胞系中,加入IL-6或过表达IL-6均可直接诱导奥希替尼耐药。基于此,IL-6与奥希替尼疗效密切相关,且可引起奥希替尼耐药。2、Lamininα5/FAK信号活化是IL-6导致肺癌奥希替尼耐药的重要机制。（1）蛋白组学分析提示Lamininα5是奥希替尼耐药后表达上调最显著的分子。多组配对的奥希替尼耐药细胞中,Lamininα5表达明显增高,si RNA干扰Lamininα5表达恢复奥希替尼敏感性,提示Lamininα5与肺癌奥希替尼耐药关系密切。（2）进一步分析蛋白组学相互作用网络,发现FAK与Lamininα5关系密切,免疫荧光及Western blot证实,P-FAK在奥希替尼耐药细胞中表达明显升高,且si RNA干扰FAK表达恢复奥希替尼敏感性,干扰Lamininα5下调P-FAK水平,提示Lamininα5、FAK活化与奥希替尼耐药密切相关。（3）在单克隆筛选获取IL-6高表达奥希替尼耐药株和IL-6低表达奥希替尼耐药株的基础上,发现干扰Lamininα5/FAK信号通路仅能恢复IL-6高表达奥希替尼耐药细胞株对奥希替尼的敏感性。在IL-6表达低的奥希替尼耐药细胞株中,Lamininα5和P-FAK水平在奥希替尼耐药后与配对敏感细胞相比未见明显变化,且干扰Lamininα5或FAK均未能对奥希替尼敏感性产生影响。提示Lamininα5/FAK特异性介导了IL-6升高所致奥希替尼耐药。3、依鲁替尼通过抑制Lamininα5/FAK信号通路克服IL-6所致的奥希替尼耐药。使用小分子药物库筛选,发现依鲁替尼可显著下调IL-6水平,进一步细胞实验及动物实验,证实依鲁替尼可显著恢复耐药细胞对奥希替尼敏感性,并抑制移植瘤的生长。分子实验提示依鲁替尼可显著抑制Lamininα5/FAK信号通路活化,而且在IL-6低表达奥希替尼耐药细胞株中依鲁替尼未能恢复奥希替尼敏感性,从而提示依鲁替尼特异性克服了IL-6升高所致奥希替尼耐药。结论:1.我们发现治疗前外周血IL-6异常升高患者使用奥希替尼疗效欠佳;使用奥希替尼的患者大部分耐药后都出现外周血IL-6进一步升高且大部分患者未检出明确耐药机制。2.我们试验证明奥希替尼耐药亚克隆细胞株中多数细胞的IL-6水平较配对敏感细胞升高;在敏感细胞中外加IL-6或内源性过表达IL-6均显著降低奥希替尼药物敏感性。由此证实,IL-6升高与奥希替尼耐药密切相关。3.我们在发现IL-6升高可诱导奥希替尼耐药基础上,进一步通过蛋白互作分析等方法发现,Lamininα5/FAK信号通路特异性介导了IL-6升高所诱导的奥希替尼耐药。4.通过小分子药物库筛选及体内外研究,我们发现依鲁替尼可通过抑制Lamininα5/FAK信号通路克服IL-6诱导的奥希替尼耐药。