延迟整流钾电流(IK)是哺乳动物和人的心室肌细胞动作电位复极主要的外向钾电流,按照通道动力学特征将IK区分为快激活(IKr)和缓慢激活IKs)两种成分。其中,IKs通道的孔区α-亚单位由KCNQ1基因编码、β-亚单位由KCNE1基因编码。现已明确,先天性KCNQ1和KCNE1基因突变可致IKs增大或减小,分别引发长QT综合征(LQT)和短QT综合征(SQT)。心脏疾病如心肌缺血、心肌肥厚、慢性心力衰竭等均伴随IKs的减小,表现为获得性LQT。LQT和SQT均以高发室性心律失常为特征。因此,研究KCNQ1/KCNE1通道的功能调节具有重要意义。越来越多的证据表明,催化磷酸化反应的蛋白磷酸激酶C(protein kinase C,PKC)家族与KCNQ1/KCNE1通道的功能调控相关,但迄今关于PKC对IKs的调节报道不尽相同,有增加和减小两种相反的结果。已知PKC家族按照结构和激活方式的不同可以分为传统型PKC(c PKC,包括α、βI、βII和γ),新型PKC(n PKC,包括δ、ε、π和θ)和非典型PKC(a PKC,包括ζ、i/λ)三大类,而不同动物种属的心肌组织均存在PKCα、βI、βII、e、θ、δ、γ等亚型。很可能上述PKC对IKs的不同调节现象是因为激活的PKC亚型不同所致。离子通道电流的大小取决于通道孔的通透性、开放概率以及细胞膜上通道数量,调节后者的因素涉及基因转录、蛋白合成、转运以及降解等环节。其中蛋白的正向转运与降解平衡是决定细胞膜上通道数量的关键环节,目前,不同PKC亚型如何调控细胞膜通道蛋白转运与降解从而影响细胞膜上通道数量尚不清楚。因此,本研究主要在分子生物学水平,利用非选择性PKC激动剂和连接透膜序列的选择性PKC激动肽,在异源表达系统上研究不同PKC亚型对细胞膜上KCNQ1表达水平的调节作用,并且探究其调节作用的机制。这对理解心肌离子通道的病理重构机制具重要意义,也将为发现以PKC亚型为靶点的新型抗心律失常药物提供重要的理论依据。第一部分不同PKC亚型对KCNQ1蛋白表达调节作用。目的:在构建的稳定表达KCNQ1/KCNE1通道的HEK293细胞系上,研究不同PKC亚型对KCNQ1总蛋白、细胞膜蛋白表达水平的影响。方法:1全细胞蛋白提取:细胞漂洗后轻轻刮下并离心,收集细胞沉淀,按照RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂(PMSF)以100:1的比例加入并使细胞沉淀充分混悬,冰上超声破碎后静置裂解,离心收集上清液。2细胞膜蛋白提取:利用生物素酰化的方法标记细胞膜蛋白,充分裂解破碎细胞后,借助珠子特异性结合的方式将生物素标记的膜蛋白分离,其余成份离心丢弃,再经洗脱,得到纯净的细胞膜蛋白成份。3 Western blot:对提取的全细胞蛋白或者细胞膜蛋白进行SDS-PAGE电泳,经湿转法转移到PVDF膜上,用TBST配制含10%脱脂奶粉的封闭液进行封闭,通过特异性的一抗与红外荧光标记的二抗结合,用ODYSSEY双色红外激光成像系统仪器进行曝光成像。4 si RNA瞬时转染:采用Lipofectin RNAmax试剂盒进行瞬时转染,铺板后24小时,细胞汇合度达到50%-60%时可进行si RNA的瞬时转染。转染4小时左右后换完全培养基。继续培养48小时后,si RNA表达完成,可进行下一步处理。结果:1不同PKC亚型对全细胞KCNQ1蛋白表达水平的影响:利用非选择性PKC激动剂PMA(100 n M)、OAG(10μM)和选择性c PKC激动肽(200 n M)、PKCε激动肽(200 n M)分别孵育24小时,Western blot检测全细胞KCNQ1蛋白表达没有明显变化(P>0.05)。2不同PKC亚型对细胞膜KCNQ1蛋白表达水平的影响:首先,验证细胞膜蛋白提取方法的敏感性。采用阳性对照药地塞米松(50 n M)(已被证实通过抑制蛋白泛素化降解,显著增加细胞膜KCNQ1蛋白表达水平)孵育6、24小时后,与对照组相比,细胞膜KCNQ1蛋白表达水平分别是对照的176%(P<0.05)和281%(P<0.05),证明实验所用的细胞膜蛋白提取方法敏感性较好。PMA、OAG以及c PKC激动肽、PKCε激动肽分别与细胞孵育6、24小时,Western blot检测细胞膜KCNQ1蛋白表达水平。结果显示,PMA孵育后细胞膜KCNQ1蛋白表达水平分别是对照的36%(P<0.01)和24%(P<0.01);c PKC激动肽孵育后,细胞膜KCNQ1蛋白表达水平分别是对照的24%(P<0.01)和30%(P<0.01);PKCε激动肽孵育后细胞膜KCNQ1蛋白表达水平是对照的34%(P<0.01)和34%(P<0.01);而OAG孵育后,细胞膜KCNQ1蛋白表达水平没有明显变化(P>0.05)。3 si RNA敲低不同PKC亚型对激动肽作用的影响:利用si RNA干扰技术,敲低不同PKC亚型表达,观察对上述PKC亚型激动肽作用的影响,进一步验证其作用的特异性。结果显示,敲低细胞PKCa和β亚型可逆转c PKC激动肽下调细胞膜KCNQ1蛋白表达的作用(P<0.05),未敲低为对照的48%,而敲低PKCa和β亚型后为对照的94%。与此相似,敲低PKCε亚型后PKCε激动肽对细胞膜KCNQ1蛋白表达的下调作用显著减弱(P<0.01),未敲低为对照的33%,而敲低PKCε亚型后为对照的68%。因此,实验进一步表明PKC亚型特异性调节细胞膜KCNQ1蛋白表达的作用。小结:在异源表达系统上,PMA、c PKC和PKCε激动肽对全细胞KCNQ1蛋白表达无明显影响,而对细胞膜KCNQ1蛋白表达均呈现明显下调作用,提示PKC通过调节通道的转运与降解过程影响细胞膜上的通道表达水平。第二部分不同PKC亚型对细胞膜KCNQ1表达调节作用的机制目的:探究激活c PKC亚型和PKCε亚型后下调细胞膜KCNQ1蛋白表达的调节作用机制。方法:观察选择性干扰细胞膜通道蛋白内吞、降解和正向转运过程的工具药对PKC亚型激动肽作用的影响,分析激活不同PKC亚型对上述过程的调节作用。细胞膜蛋白提取和Western blot方法同第一部分。结果:1对细胞膜蛋白内吞过程影响:观察内吞抑制剂Dynasore(80μM)对激活不同PKC亚型作用的影响。结果显示,PMA与Dynasore共同孵育6小时后对细胞膜KCNQ1蛋白表达的下调作用被明显抑制(P<0.01),单独孵育表达水平为对照的34%,而共同孵育为对照的89%;与此相似,c PKC激动肽与Dynasore共同孵育对细胞膜KCNQ1蛋白表达的下调作用同样被明显抑制(P<0.01),单独孵育表达水平为对照的24%,而共同孵育为对照的89%。上述结果表明PMA和c PKC激动肽通过促进马达蛋白介导的内吞途径使细胞膜KCNQ1蛋白加速降解而发挥下调作用。与此相反,PKCε激动肽与Dynasore共同孵育对KCNQ1细胞膜蛋白表达的下调作用未受影响(P>0.05),单独孵育表达水平为对照的29%,而共同孵育表达水平为对照的39%,提示PKCε激动肽并非通过影响内吞过程减少细胞膜KCNQ1表达水平。此外,单独孵育Dynasore并不明显改变细胞膜KCNQ1蛋白表达水平,可能是其他代偿的方式弥补了马达蛋白介导的内吞途径阻断所带来的影响。2对细胞膜蛋白降解的影响:加入正向转运阻断剂Brefeldin A(BFA)(10μM)后利用Western blot检测不同时间细胞膜上KCNQ1蛋白表达水平,可以反映出通道细胞膜蛋白降解速度。结果显示,以各自0小时细胞膜KCNQ1蛋白表达水平为100%,BFA对照组孵育6、24小时分别是0小时的72%和39%,c PKC激动肽共孵育分别是30%和14%,与对照相比降解显著增多(P<0.01);而PKCε激动肽共孵育分别是68%和33%,降解程度与对照相比无明显差别(P>0.05)。结果进一步验证了激活c PKC亚型通过加速内吞降解过程下调细胞膜KCNQ1蛋白表达水平,而激活PKCε亚型对细胞膜KCNQ1蛋白表达的下调作用则可能是通过抑制蛋白正向转运或者再循环过程而实现的。与此类似,我们也观察了PMA对蛋白降解的影响。结果显示,BFA对照组孵育后细胞膜KCNQ1蛋白表达水平分别是0小时的82%和32%,而PMA共孵育分别是45%和14%,两个时间点的降解程度均显著高于对照(P<0.01),表明PMA也通过加速内吞降解过程来下调细胞膜KCNQ1蛋白表达水平。结果提示尽管PMA为非选择性PKC激动剂,但其作用机制与c PKC亚型相似,可能在此实验系统PMA主要通过激活c PKC亚型下调细胞膜KCNQ1蛋白表达水平。小结:PMA和c PKC激动肽加速了通道细胞膜蛋白的内吞降解,而PKCε激动肽则可能抑制了蛋白正向转运或者再循环过程降低细胞膜KCNQ1蛋白表达量。结论:在异源表达系统上,c PKC与PKCε亚型均可显著降低细胞膜KCNQ1蛋白表达水平,其机制是c PKC亚型加速蛋白内吞、降解过程,而PKCε亚型不影响此过程,可能是其抑制蛋白正向转运或者再循环过程。