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慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种在世界范围内广泛流行、严重危害人类健康的传染性疾病。而我国是乙型肝炎高发区之一，约有1.3亿HBV携带者。临床上所用的抗HBV药物主要有核苷类药物和干扰素。核苷类药物具有很强的抗HBV效果，但长期应用会产生耐药性，停药后出现反弹，且有一定的毒副作用。干扰素给药不方便，且不良反应严重。另外，免疫性肝损伤在乙型肝炎复杂的发病机制中占有重要的地位。当机体免疫系统不能清除大量的HBV时，强烈的细胞免疫反应、体液免疫反应及肝细胞膜特异性抗原免疫反应会导致肝脏的炎性病变。因此，研究和开发具有抗病毒和保护肝损伤双功效的药物具有重要的意义。
研究已经报道一类新药FNC（2-脱氧-2-β-氟代-4-叠氮胞嘧啶）具有良好的抗HBV活性，联苯双酯(α-DDB)具有明显的保肝降酶活性，还具有免疫调节、抗氧化、抗纤维化、抗病毒等多重作用。我们结合一类新药FNC较好的抗HBV活性，以及α-DDB良好的抗炎保肝活性，设计合成了一系列核苷类似物与五味子丙素同系物通过酯键连接起来的新型核苷-联苯双酯化合物。这些化合物具有两个药理活性基团，我们将对其可能的药理活性进行探讨。本课题首先采用HepG2.2.15细胞株，通过MTT、ELISA法对5个化学合成的核苷-联苯双酯化合物进行体外活性初步筛选;然后对筛选出的化合物进行体外抗HBV活性、体内抗鸭乙肝病毒(DHBV)活性评价及其对免疫性肝损伤小鼠的保护作用进行探讨。
第一部分:核苷-联苯双酯化合物体外抗HBV活性筛选。
[目的]从5个核苷-联苯双酯化合物中筛选出毒性低、抗HBV活性高的化合物。
[方法]采用HepG2.2.15细胞株，拉米夫定(3TC)作为阳性对照药，通过MTT法检测受试化合物对细胞的毒性作用，采用ELISA法检测受试化合物对作用于细胞第3、6和9天上清液中HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。通过FQ-PCR法检测受试化合物对细胞内外HBV DNA的影响。以受试化合物对细胞的半数毒性浓度(CC50)、对细胞培养上清液中两种抗原的抑制作用以及对细胞内外HBV DNA的抑制作用为指标，对5个化合物进行体外抗HBV活性评价。
[结果]通过5个化合物对细胞毒性的筛选，我们发现化合物Y-41、Y-8和Y-21的毒性相对较低，CC50分别为1546.5μM、965.4μM和391.8μM;3个化合物在较低浓度下对细胞第3、6和9天上清液中HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用，且化合物Y-8(α-DDB-FNC)效果较好;另外，化合物α-DDB-FNC对细胞内外HBVDNA的抑制作用随着药物浓度的增加和用药时间的延长而不断增强，浓度为0.1、0.5和2.5μM时，对第9天细胞外HBVDNA的抑制率分别为46.96％、53.57％和77.74％;对第9天细胞内HBV DNA的抑制率分别为48.18％、65.31％和78.94％。
[结论]化合物α-DDB-FNC对HepG2.2.15细胞的毒性较低，对HBsAg和HBeAg分泌的表达和细胞内外HBV DNA的复制均具有一定的抑制作用，值得对其抗HBV活性作进一步的研究。
第二部分:化合物α-DDB-FNC体内抗DHBV活性的研究。
[目的]观察化合物α-DDB-FNC体内抗DHBV的活性。
[方法]采用3日龄河南麻鸭接种DHBV强阳性血清，7天后用PCR法筛选出DHBV强阳性鸭，尔后给于不同剂量的α-DDB-FNC，阳性对照药为3TC，连续给药10天。应用SYBR GreenⅠ FQ-PCR法检测T5、T10和P3血清和肝组织中的DHBVDNA水平，评价其抗DHBV活性。然后应用HE染色法对鸭肝组织病理学变化进行观察，评价其对肝组织的改善作用。
[结果]α-DDB-FNC的浓度为10 mg/kg时，对T5和T10鸭血清中DHBVDNA的抑制率分别为95.51％和96.81％，阳性对照组3TC(20 mg/kg)为78.07％和97.10％;对鸭肝组织中DHBVDNA的抑制率分别为87.47％和97.21％，阳性对照组3TC(20 mg/kg)为86.21％和95.46％。实验结果显示，一定剂量范围内α-DDB-FNC随着用药剂量的增加和用药天数的延长存在量效与时效反应关系，且化合物α-DDB-FNC对鸭肝组织病理学损伤具有显著地改善作用。
[结论]化合物α-DDB-FNC能够显著地抑制DHBV的复制并对鸭肝组织有一定的改善作用。
第三部分:化合物α-DDB-FNC对免疫性肝损伤小鼠的保护作用。
[目的]探讨化合物α-DDB-FNC对Con A所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用。
[方法]采用Con A建立小鼠免疫性肝损伤模型，给于不同剂量的α-DDB-FNC(75，150和300 mg/kg)，阳性对照药为联苯双酯(150 mg/kg)，连续灌胃给药5天。用全自动生化仪检测小鼠血清中ALT、AST和TBiL的含量;用MDA、NO试剂盒检测小鼠肝组织中MDA和NO的含量;用HE染色法对小鼠肝组织病理学变化进行观察，从而评价化合物α-DDB-FNC的保肝活性。
[结果]化合物α-DDB-FNC各剂量组血清中ALT、AST和TBiL含量及肝组织中MDA、NO含量均明显低于模型组，肝组织病理变化明显减轻。
[结论]化合物α-DDB-FNC对Con A所致小鼠免疫性肝损伤具有较好的防治作用。