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目的:通过体外细胞实验和体内动物实验从缺氧-VEGF途径探讨止血化瘀利水方治疗视网膜静脉阻塞性黄斑水肿及其新生血管相关性并发症的作用及调控机理,为中医“络病论治”、“理血治水”治疗RVO黄斑水肿等新生血管相关并发症提供初步的理论依据,丰富中医治疗眼底血证理论。方法:1.通过体外细胞实验观察止血化瘀利水方对缺氧诱导ARPE-19细胞VEGF及其相关因子表达的影响,并探讨其作用机理:体外培养ARPE-19细胞,取对数期生长状态良好的细胞,分为正常组、中药空白组、缺氧模型组、阳性对照组与中药组。首先用不同浓度CoCl2进行诱导培养24h、48h、72h后,CCK-8法检测细胞的增殖活性,以筛选出最佳CoCl2浓度用于建立细胞缺氧模型;采用ELISA法检测细胞上清液中VEGF的蛋白浓度;Western Blot法检测细胞中HIF-1α、NF-KB p65、NF-KB p-p65的蛋白表达水平;Realtime-RT-PCR法检测细胞VEGFmRNA和HIF-1αmRNA的表达水平,具体内容见实验一章节。2.通过体内动物实验观察止血化瘀利水方对视网膜静脉阻塞模型兔视网膜组织内VEGF及其相关因子表达的影响,并探讨其作用机理:以光化学法诱导新西兰兔RVO模型,将造模成功后的RVO兔随机分为模型组与中药组,正常对照组为未进行造模的同龄正常新西兰兔。各项指标检测时间节点分别为造模后7d、14d、21d、28d。采用免疫组化法检测兔视网膜中VEGF、HIF-1α、NF-KB p65的蛋白分布;Western Blot法检测兔视网膜中VEGF、HIF-1α NF-KB p65的蛋白表达水平;Realtime-RT-PCR法检测实验兔视网膜中VEGFmRNA和HIF-1αmRNA的表达水平,具体内容见实验二章节。结果:1.体外细胞实验(1)细胞缺氧模型的建立:实验中通过CCK-8法检测ARPE-19细胞增殖活性,证实CoCl2可诱导出细胞缺氧状态,并筛选出建模CoCl2最佳浓度为200μmol/L和含药血清最佳浓度为20%以应用于以下实验研究。(2)细胞ELISA检测结果:各组细胞的VEGF蛋白浓度在24h、48h、72h3个时间点均随时间延长呈递增趋势,与正常组相比,缺氧模型组升高,差异有统计学意义(t24h=9.794,t48h=7.447,t72h=10.466,P24,48,72h<0.001)。与缺氧模型组相比,空白对照组差异无统计学意义(P>0.05),阳性对照组显著降低(t24h=2.897,P24h<0.01;t48h=2.308,P48h<0.05;t72h=4.748,P72h<0.001),中药组显著降低(t24h=4.242,t48h=3.430,P24.48h<0.001;t72h=2.501,P72h<0.01);中药组与阳性对照组比较,两组在48h和72h有显著性差异(t48h=2.429,t72h=1.933,P48,72h<0.05)。(3)细胞Western blot检测结果:①HIF-1α蛋白在各组细胞中的相对表达结果显示,与正常组相比,中药空白组差异无统计学意义(P>0.05),缺氧模型组各时间点均升高,在72h差异有统计学意义(t=4.593,P<0.01);与缺氧模型组相比,中药组各时间点均降低,在72h差异有统计学意义(t=2.873,P<0.05)。②NF-KB p65和NF-KB p-p65蛋白在缺氧模型组中未表达,中药组中少量表达。(4)细胞Realtime-RT-PCR检测结果:①VEGFmRNA的表达结果显示,与正常组相比,缺氧模型组各时间点均增加,差异有统计学意义(t24h=4.946,t48h=12.863,P24,48h<0.001;t72h=5.561,P72h<0.05);与缺氧模型组相比,阳性对照组与中药组在24h和48h减少,72h增加,在3时相,阳性对照组差异有统计学意义(t24h=3.437,P24h<0.01;t48h=13.554,P48h<0.001;t72h=2.219,P72h<0.05);中药组差异有统计学意义(t24h=3.084,t72h=6.115,P24h,72h<0.01;t48h=14.837,P48h<0.001),而这两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②HIF-1αmRNA的表达结果显示,与正常组相比,缺氧模型组各时间点均显著增加(t24h=2.658,P24h<0.05,t48h=6.150,P48h<0.001,t72h=3.203,P72h<0.01);与缺氧模型组相比,阳性对照组与中药组在各时间点均减少,在48h时两组差异有统计学意义(t阳性对照组=14.918,t中药组=15.358,P阳性对照,中药组<0.001);这两组间的两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.体内动物实验(1)RVO兔模型的建立:实验中眼底镜下观察及FFA和眼底彩照结果显示,造模后实验兔均出现光凝静脉阻塞表现,动物死亡率较低,证实了该方法建立的RVO动物模型的安全可靠。(2)兔视网膜免疫组化结果:①VEGF:正常组兔视网膜血管内皮细胞、神经节细胞层、内外核层、RPE细胞及脉络膜血管内皮细胞中均有少量VEGF表达,模型组和中药组VEGF 阳性表达主要见于造模区域的视网膜血管内皮细胞胞浆、神经节细胞核、RPE细胞胞浆及脉络膜血管内皮细胞胞浆。AOD结果显示,自造模后7d-28d VEGF 阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义(t7d=10.232,t14d=9.895,t21d=10.952,t28d=12.772,P7-28d<0.001);与模型组相比,中药组中药干预后均显著减弱(t7d=2.233,P7d<0.05;Z14d=2.873,P14d<0.01;t21d=6.648,t28d=7.710,P21d,28d<0.001);AG 结果显示,自造模后 7d-28d VEGF 阳性表达,模型组均强于正常组,差异有统计学意义(t7d=6.847,t14d=8.751,t21d=9.637,t28d=8.417,P7-8d<0.001);21d 和 28d 中药组均显著低于模型组(t21d=3.967,P21d<0.001;t28d=3.532,P28d<0.01)。AOD 与 AG 结果总体一致,模型组的表达水平较稳定,中药组随时间延长阳性表达逐渐减弱。②HIF-1α:正常组兔视网膜血管内皮细胞、神经节细胞层、内外核层、RPE细胞及脉络膜血管内皮细胞中均有少量HIF-1α表达,模型组和中药组HIF-1α阳性表达主要见于视网膜血管内皮细胞胞浆、神经节细胞核、内外核层、RPE细胞胞浆及脉络膜血管内皮细胞胞浆。AOD结果显示,自造模后7d-28d HIF-1α阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义(Z7-28d=3.780,P7-28d<0.001);与模型组相比,中药组均显著减弱(t7d=5.041,t14d=10.218,t28=4.766,P7d14d,28d<O.001;t21d=3.451,P21d<0.01);AG结果显示,自造模后7d-28d HIF-1α阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义(t7d=11.795,t14d=8.751,P7d.14d<0.001 t21d=2.674,Z28d=2.419,P21d,28d<0.05);与模型组相比,中药组在 7d、14d、28d 均减弱,但在14d差异有统计学意义(t=4.358,P<0.001)。AOD与AG结果显示模型组表达趋势基本一致,在14d表达最强;中药组阳性表达总体上低于模型组,并且随时间延长表达逐渐减弱。③NF-KB p65:正常组兔视网膜在神经节细胞核和内外核层有棕黄色阳性染色,较分散。模型组和中药组NF-KB p65阳性表达主要见于视网膜血管内皮细胞胞浆、神经节细胞核、内核层及外核层细胞核。AOD结果显示,自造模后7d-28d NF-KB p65阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义(t7d=4.264,t14d=15.027,t21d=1 1.026,t28d=8.073,P7-28d<0.001);与模型组相比,中药组均减弱,在14d、21d、28d差异有统计学意义(t14d=4.579,t28d=5.232,P14d,28d<0.001;t21d=3.266,P21d<0.01);AG 结果显示,自造模后7d-28d NF-KB p65阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义(t7d=8.026,t14d=8.426,t21d=8.013,t28d=4.478,P7-28d<0.001);与模型组相比,中药组均显著减弱(t7d=4.579,t14d=3.769,P7d,14d<0.001;t21d=3.176,P21d<0.01;t28d=2.531,P28d<0.05)。AOD 与 AG 结果基本一致,模型组在 14d 时表达最高,中药组随时间延长表达逐渐减弱。(3)兔视网膜Western blot结果:①VEGF蛋白的表达结果显示,在视网膜细胞胞浆中的表达:与正常组相比,模型组在各时间点均降低;与模型组相比,中药组在7d、14d、21d均降低,并随时间延长而逐渐降低。而在视网膜细胞胞核中的表达:与正常组相比,模型组在14d、21d、28d增加;与模型组相比,中药组在14d、21d、28d降低,并随时间延长而逐渐降低,但以上组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。②HIF-1α蛋白的表达结果显示,在视网膜细胞胞浆中的表达:与正常组相比,模型组在7d和21d增加;与模型组相比,中药组在21d降低。而在视网膜细胞胞核中的表达:与正常组相比,模型组在14d增加,中药组在7d、14d、21d降低,但以上组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。③NF-KB p65蛋白的表达结果显示,在视网膜细胞胞浆中的表达:与正常组相比,模型组在7d、21d和28d增加;与模型组相比,中药组在7d、21d降低。而在视网膜细胞胞核中的表达:与正常组相比,模型组在各时间点均增加;与模型组相比,中药组在各时间点均降低,但以上组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)兔视网膜Realtime-RT-PCR结果:①VEGFmRNA的相对表达量:与正常组相比,模型组在7d、14d、21d表达水平升高,7d和14d时差异有统计学意义(t7d=2.935,t14d=3.149,P7,14d<0.05),而且在14d时表达水平最高;与模型组相比,中药组在各时间点表达水平均降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。②HIF-1αmRNA的相对表达量:与正常组相比,模型组各时间点表达水平均升高,在14d差异有统计学意义(Z=-2.087,P<0.05),而且在14d时表达水平最高;与模型组相比,中药组在7d、14d、21d表达水平降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1.CoCl2可成功诱导ARPE-19细胞缺氧模型,以更好的模拟体内缺氧环境。2.体外细胞实验:缺氧诱导ARPE-19细胞中VEGF、HIF-1α表达升高,提示缺氧环境下细胞趋化两因子的高表达。3.止血化瘀利水方与复方血栓通含药血清对缺氧损伤后ARPE-19细胞的增殖和VEGF、HIF-1α表达均起抑制作用,因此推测改善缺氧环境及抑制VEGF是中药在治疗RVO中发挥作用的关键机制。4.光化学法可成功诱导RVO兔模型,具备动物死亡率低及成功率高的优点。5.体内动物实验:RVO兔模型视网膜中VEGF、HIF-1α、NF-KB p65表达升高,在14d时尤为明显,提示以上三因子参与了 RVO及其并发症的病理过程,14d为相关因子维持的时间转折点。6.止血化瘀利水方对RVO兔模型视网膜中VEGF、HIF-1α和NF-KB p65起到较好的抑制调节作用,表明该中药可能是通过改善视网膜缺血缺氧途径,减少VEGF等新生血管生长相关因子产生,从而达到防治RVO引起的ME及新生血管性并发症的目的。7.结合体外实验与体内实验的结果表明,止血化瘀利水方可能通过缺氧-VEGF途径对RVO及ME、新生血管性并发症具有较好的防治作用。