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目的:肿瘤微环境在肿瘤的发生发展中起重要作用,目前已成为化疗耐药的新靶标。趋化因子受体CXCR4和其特异性配体CXCL12(SDF-1)、Axl受体酪氨酸激酶和其配体Gas6是介导肿瘤细胞与其微环境相互作用的两个关键的配体-受体对;阻断CXCR4/CXCL12的相互作用可抑制乳腺癌的生长、转移及肿瘤血管生成,而Axl拮抗剂能逆转肿瘤化疗耐药。本研究的目的是扩展实验室前期研发的CXCR4拮抗多肽E5在肿瘤治疗中的适应症,探究E5联合化疗药对乳腺癌小鼠模型的治疗效果及其作用机理。同时,筛选与Axl具有高结合力的新型多肽分子,探究其与不同肿瘤细胞的作用及与化疗耐药的关系。方法:利用流式细胞术检测人急性髓系白血病细胞(HL60、U937、THP-1、NB-4)、人慢性髓系白血病细胞K562和人乳腺癌细胞MCF7在化疗药暴露环境中,及多种耐药细胞株表面Axl的表达,评价Axl与化疗耐药的相关性;检测系列合成多肽分子与K562和MCF7/R的结合力,筛选与Axl具有高结合力的多肽。通过逐步增加阿糖胞苷浓度,反复刺激U937细胞,构建U937耐药株(U937R)。利用流式细胞术检测E5与小鼠乳腺癌细胞4T1、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC和小鼠骨髓基质细胞MS-5的结合力,评价E5的特异性。利用CCK8检测E5对4T1、HUVEC和MS-5细胞活性的影响。利用Annexin V/PI双染和Western blot评价E5对4T1细胞的杀伤作用。利用Transwell迁移小室检测E5对CXCL12和MS-5条件培养基介导的4T1和HUVEC细胞迁移的影响。用CCK8方法检测E5对基质细胞介导的4T1细胞粘附的影响。建立4T1与MS-5细胞、MS-5条件培养基和CXCL12共培养体系,通过CCK8法检测E5联合多种化疗药对4T1细胞的杀伤作用。将E5与紫杉醇或环磷酰胺联合,治疗皮下接种4T1乳腺癌细胞的小鼠;通过监测小鼠肿瘤尺寸来评价治疗效果。用Western blot检测小鼠肿瘤组织中CXCR4、CXCR4相关下游信号蛋白p-Akt、p-Erk及血管内皮细胞标记分子CD31的表达,探讨E5提高化疗药治疗效果的作用机理。将FITC标记的E5皮下注射至小鼠体内后,利用活体成像系统和荧光酶标仪分别检测小鼠组织器官和血液中的荧光强度来评价E5在健康小鼠体内的代谢情况。用高效液相色谱检测E5在体外的贮藏稳定性。结果:(1)E5能与表达CXCR4的4T1细胞和HUVEC细胞特异性结合;对4T1细胞的杀伤作用具有浓度依赖性,低于25 μM的E5对细胞活性无明显影响,高于25μM时,可诱导细胞凋亡。E5能有效抑制CXCL12和MS-5条件培养基介导的4T1细胞的迁移以及由MS-5细胞介导的4T1细胞的粘附。在MS-5细胞、MS-5条件培养基或CXCL12存在条件下,E5能有效提高4T1细胞对紫杉醇、榄香烯或顺铂的敏感性。在乳腺癌小鼠模型中,E5能降低肿瘤组织中CXCR4、p-Akt、p-Erk和CD31的表达,抑制肿瘤血管生成,提高紫杉醇或环磷酰胺的抗肿瘤效果。在健康小鼠体内,E5主要通过肝脏代谢,注射2 h后可达到最高血药浓度,半衰期约为10 h。E5在37℃可存放9天,在4℃可存放5个月。(2)化疗药瞬时刺激能诱导U937和K562细胞表面Axl的表达;Axl的配体Gas6能明显提高K562细胞表面Axl的表达。建立了 U937阿糖胞苷耐药株,U937R。与正常细胞株相比,血液肿瘤细胞HL60、U937、K562的耐药株(HL60/A、U937R、K562/A)表面Axl的表达有所不同,HL60/A无明显变化、U937R有轻微升高,K562/A有明显降低;实体瘤细胞MCF7耐药株(MCF7/R)Axl的表达明显升高。从高表达Axl的细胞株K562和MCF7/R上筛选出与Axl具有高结合力的多肽,命名为A2-7,为后续工作奠定基础。结论:E5通过拮抗CXCR4/CXCL12轴有效抑制了由CXCL12介导的小鼠乳腺癌4T1细胞的迁移和粘附功能,增加了 4T1细胞对化疗药的敏感性,提高了化疗药对乳腺癌小鼠的治疗效果。E5通过阻断对血管内皮前体细胞的招募抑制肿瘤血管的生成。E5具有较好的体内稳定性,半衰期约为10 h。在37℃贮藏条件下易降解,在4℃可存放5个月。多肽A2-7与K562、MCF7/R细胞表面的Axl具有较高结合力,可能是一种潜在的Axl拮抗多肽。